Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
Het DNA nanorobot een holle zeshoekige nanometrische inrichting, ontworpen om in reactie op specifieke stimuli en presenteren lading binnen afgezonderd. Zowel stimuli en lading kan worden afgestemd op specifieke behoeften. Hier beschrijven we de DNA nanorobot fabricage protocol, met behulp van de DNA origami techniek. De procedure initieert door het mengen van korte enkelstrengs DNA-nietjes in een voorraad mengsel dat vervolgens naar een lange, cirkelvormige, enkelstrengs DNA scaffold wordt toegevoegd in aanwezigheid van een opvouwbare buffer. Een standaard thermo cycler geprogrammeerd om het mengen reactietemperatuur geleidelijk te verlagen om de krammen te scaffold gloeien, de drijvende kracht achter het vouwen van de nanorobot vergemakkelijken. Nadat het 60 uur vouwreactie is voltooid, wordt overmaat nietjes verwijderd met behulp van een centrifugaal filter, gevolgd door visualisatie via agarose-gelelektroforese (AGE). Tenslotte wordt een succesvolle vervaardiging van de nanorobot geverifieerd door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM),het gebruik van uranyl-formiaat als negatief vlek.
Introduction
De toepassingen voor nucleïnezuren nanotechnologie zijn verbazingwekkend. De volgzaamheid van de Watson-Crick baseparing en het gemak en de relatief lage kosten van grootschalige synthese van op maat gemaakte oligo 2 een explosie toepassingen 3 en onderzoek op het gebied van DNA nanotechnologie gegenereerd. Structurele DNA nanotechnologie, gebaseerd op de immobiele Seeman knooppunt 4,5 als hoeksteen maakt gebruik van DNA als een zelfassemblerende elementaire eenheid voor de constructie van willekeurige vormen 6-8.
De recente ontwikkeling van de steigers DNA Origami 9-techniek maakt de constructie van complexe 2D / 3D nano-architecturen 10-12 met sub-nanometer precisie en een efficiënte route voor het bouwen van nieuwe functionele objecten met toenemende complexiteit en verbazingwekkende diversiteit. De constructie is gebaseerd op een lange scaffold enkelstrengs DNA, gewoonlijk afgeleid van een viraal genoome, die kunnen worden gevouwen door de hybridisatie van honderden korte enkelstrengs DNA-oligo genoemd nietjes. De hoge structurele resolutie verkregen met deze techniek is het directe gevolg van de natuurlijke omvang van de DNA dubbele helix, terwijl de reproduceerbaarheid van fabricage is het resultaat van afstemming van de korte enkelstrengs sequenties nietje de maximum waterstofbinding complementariteit haalbaar vergemakkelijken. Met het gebruik van een langzame temperatuur annealing de helling gemaakt laagste energie thermodynamisch voorkeur nanostructuur in hoge opbrengsten en betrouwbaarheid wordt bereikt. De eenvoudige implementatie van ontwerpregels knooppunt in een computercode kon de ontwikkeling van CAD-hulpmiddelen, zoals caDNAno 13, dat zeer de taak van het ontwerpen van grote, complexe structuren met honderden verbonden knooppunten vereenvoudigen.
Eerder beschreven we het ontwerp van een DNA nanorobot met behulp van het gereedschap caDNAno 14,15. Hier tonen we de fabricage envisualisatie via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van de nanorobot een 3D holle zeshoekige nanodevice, met afmetingen van 35 x 35 x 50 nm 3, die een belangrijke conformationele verandering in reactie ondergaan een voorafbepaalde stimuli en dit specifieke lading, zoals eiwitten of nucleïnezuur oligo, afgezonderd binnen. Terwijl 12 laadstations zijn beschikbaar in de holle chassis, het werkelijke aantal gebonden lading verschilt met lading grootte. Lading moleculen variëren van kleine DNA-moleculen enzymen, antilichamen en 5-10 nm goud nanodeeltjes. Cargocan ofwel uniform of heterogeen, zodat elke nanorobot bevat een mengsel van verschillende moleculen. Sensing wordt bereikt via twee dubbele helix vergrendeling poorten ontwerp tot eiwitten, nucleïnezuren of andere chemische stoffen te voelen, hetzij op basis van aptasensor 16,17 of DNA-streng verplaatsing 18 technologieën. Recente ontwikkelingen in aptameer selectie protocollen 19-21 staat het ontwerp van nanorobots reagereneen steeds groeiend aantal moleculen en celtypen.
Eerder werk toonde een nanorobot met een specifiek antilichaam, die bij kan binden aan het antigeen ervan relais ofwel een remmend of een vruchtbare signaal naar de binnenkant van specifieke celtypen in een gemengde celpopulatie 15. Een interessante eigenschap van deze nanodevices is hun vermogen om nog meer complexe taken en logische regeling uitvoeren met de introductie van verschillende nanorobot subtypes in één populatie. Onlangs toonden we specifieke subtypen van nanorobots uitvoeren als positief of negatief regelen, besturen van een effector populatie die een actief molecuul cargo 22.
De hier gepresenteerde protocol beschrijft de vervaardiging, zuivering en beeldvorming van een nanorobot omheind met sensor aptameer sequenties die selectief PDGF binden aan de opening van de nanorobot 15,22 vergemakkelijken. Het fabricageproces beschreven is vergelijkbaar met de nanorobot fabricageproces aanvankelijk afgebeeld door Douglas et al. 15 met de veranderingen die gericht zijn op vermindering van de totale duur proces, terwijl het verhogen van de opbrengst en zuivering tarieven.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschreven de vervaardiging, zuivering en visualisatie van de DNA nanorobot. Na vervaardiging van de hexagonale chassis van de inrichting, is de functie van de nanorobot geprogrammeerd met de eenvoudige introductie van specifieke vracht en waarneming strengen de robot die gemakkelijk hun aangewezen positie ondervinden van de waterstofbinding complementariteit met beschikbare enkelstrengs docking plaatsen 14 , 15,22.
De fabricage beschreven protocol gebruikt een langzame anneali…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen S. Douglas bedanken voor zeer waardevolle discussies en advies, en alle leden van de Bachelet lab voor nuttige discussies en werk. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de faculteit Life Sciences en het Instituut voor Nanotechnologie & Advanced Materials aan de Bar-Ilan Universiteit.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Riferimenti
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
