ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Summary
כאן אנו מתארים זרימת עבודה עבור מהירות ניתוח ולחקור את האוספים של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות PhenoRipper, פלטפורמת דימוי ניתוח שפותחה לאחרונה.
Abstract
למרות התקדמות מהירה במיקרוסקופיה תפוקה גבוהה, מבחני מבוססי תמונת כמותית עדיין להוות אתגר משמעותי. בעוד מגוון רחב של כלים לניתוח תמונה מיוחדים זמין, רוב זרימות עבודה המבוססת על דימוי ניתוח מסורתי עקומות תלולות למידה (לכוונון עדין של פרמטרים ניתוח) ולגרום לזמני אספקה ארוכים בין ההדמיה וניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונה, הוא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה.
כאן אנו מציגים חלופי,-ללא פילוח תא זרימת עבודה המבוססת על PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח המיועדת לניתוח והבדיקה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים. הצינור שהוצג כאן הוא מותאם לתמונות מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרביות תאים ודורש התערבות משתמש מינימאלית. תוך חצי שעה, PhenoRipper יכול לנתח נתונים מניסוי 96 היטב טיפוסי וליצור פרופילי תמונה. משתמשים יכוליםאז מבחינה ויזואלית לחקור את הנתונים שלהם, לבצע בקרת איכות בניסוי שלהם, להבטיח תגובה להפרעות וסמנו את שחזור של משכפל. זה מקל על מחזור משוב מהיר בין הניתוח וניסוי, שהוא חיוני במהלך assay אופטימיזציה. פרוטוקול זה שימושי לא רק כניתוח ראשון לעבור לבקרת איכות, אלא גם יכול לשמש כפתרון קצה לקצה, במיוחד להקרנה. זרימת העבודה המתוארת כאן מאזניים לערכות נתונים גדולים כמו אלה שנוצרו על ידי מסכי תפוקה גבוהה, והוכחה תנאי ניסוי קבוצה על ידי פנוטיפ מדויק על פני טווח רחב של מערכות ביולוגיות. ממשק PhenoBrowser מספק מסגרת אינטואיטיבי כדי לחקור את חלל פנוטיפי ומתייחס מאפייני תמונה להסברים ביולוגיים. יחדיו, הפרוטוקול המתואר כאן יוריד את החסמים לאימוץ ניתוח כמותי של מסכי מבוססי תמונה.
Introduction
במהלך העשור האחרון, התקדמות מהירה בטכנולוגיית הדמיה נתנו מעבדות רבות את היכולת לבצע מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה. האתגר כעת עבר מאחד לאחד של הדמיה של ניתוח. איך אנחנו יכולים לאפיין, להשוות, ולחקור את סיקור של פנוטיפים אך עדינים מורכבים שנוצרו על ידי מסך הדמיה תפוקה גבוהה טיפוסי?
מספר פלטפורמות דימוי ניתוח ואינפורמטיקה נתן ארגזי כלים מתוחכמים משתמשי 1-3 לחילוץ מידע ביולוגי מאוספים גדולה של תמונות. עם זאת, רבי מכשולים משמעותיים להישאר בניתוח נתונים ממסכים מבוסס תמונת תפוקה גבוהה. קשיים כרוכים בבחירת אפיונים מתאימים של התמונות וכוונון עדין של פרמטרים אלגוריתמיים (למערכת של עניין) לעתים קרובות לגרום להתקנה פעמים רבות, במיוחד עבור משתמשים ללא מומחיות דימוי ניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונת n, היא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה. פילוח יכול להיות רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים וביו סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת ונשנית לערכת נתונים גדולה. מסיבות אלה, ניתוח תמונה הוא לעתים קרובות צעד עצמאי, מסוף שבוצע על ידי מומחים ולא חלק משולב של זרימת העבודה הניסיונית. זה מונע את מחזור המשוב המהיר בין הניתוח וניסוי, חלק חיוני של פיתוח assay.
כאן אנו מתארים זרימת עבודה חלופית כי הוא מותאם למיקרוסקופ פלואורסצנטי תפוקה גבוהה ומונעת הרבה מהקשיים האמורים לעיל. לשם כך, אנו עושים שימוש 4 PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח לחיפוש וניתוח של תמונות מיקרוסקופ מהירים. באופן משמעותי, PhenoRipper נמנע רבים מהאתגרים כרוכים בפילוח תא על ידי לא מנסה לזהות תאים בודדים. במקום זאת, PhenoRipper מחלק תמונות לתוך פיקסלבלוקים של גודל subcellular ומאפיינים את הדמויות במונחים של בלוקים שהם מכילים. באופן ספציפי, PhenoRipper פרופילי לוקים במונחים של-מבוסס colocalization סמן תכונות ומזהה באופן אוטומטי 4 הסוגים לחסום הנציג ביותר בתמונות אימונים. PhenoRipper לאחר מכן מקצה לכל בלוק סוג בלוק נציג הדומה ביותר, ולבסוף מאפיין תמונות המבוססות על סוגים בלוקים שהם מכילים.
בהשוואה ליותר יחידה מבוסס תאי גישות מסורתיות, גישה זו דורשת כוונון עדין ומומחיות מינימאליים. ככזה, משתמשים רק צריכים להגדיר שני פרמטרים: גודל הבלוק ועוצמת סף (להשליך חלקי noncellular של תמונה), אשר שניהם נקבעים עם משוב גרפי. חשוב מכך, זרימת העבודה שתוארה כאן הוכח 4 בקנה מידה בקלות לערכות נתונים גדולים בהרבה, שבו המהירות והכוונון עדין מינימאלי מספקת זמן גדול ורווחי אמינות. בפועל, אנו מוצאים כי יישום זהמקק מפחית את הזמן הנדרש הן להתקנה ולהפעלתו על ידי צווים שונים של גודל 4.
התפוקה העיקרית של PhenoRipper היא ייצוג חזותי של דמיון תמונה, המאפשרת למשתמש לזהות קבוצות של תנאי ניסוי שגורמים לתאים להציג פנוטיפים דומים. יש הקבוצות PhenoRipper מוצאת בדרך כלל "interpretability ביולוגי" דומה לאלה שנוצרו על ידי יותר, שיטות מבוססות תאי זמן רב 4. בפועל, זה אומר כי לעתים קרובות, בתוך חצי שעה של ביצוע ניסוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 96 היטב טיפוסי, הנסיין ללא ניסיון דימוי ניתוח לפני יכול לקבל קריאת נתונים אמינות לגבי הביצועים של הניסוי שלו או שלה. הנסיין אז יכול להתחיל לחקור את יחסי הגומלין בין תנאי ניסוי שונים ומתייחס ליחסים אלה פנוטיפים תמונה.
אנו מדגימים זרימת עבודה זו לכאן על ידי ניתוח ההשפעותשל תרופות בכיתות מכניסטית מובחנות בתאי הלה מוכתמים עבור סמני DNA וcytoskeletal. תמונות של תאים שטופלו באותה הכיתה של תרופות קובצו יחד, ותמונות באיכות ירודה (חפצים מכתים, מתוך תאי מיקוד וכן הלאה) הופיעו כחריגים, מה שהופך אותם קלים לזהות ואפשרות למחוק.
בעוד זרימת עבודה זו היא שימושית עבור מספר רב של מבחני המבוסס על תמונה, יש מצבים רבים שבם בבירור בגישה שונה עלולה להיות יותר אינפורמטיבי. לדוגמא, הפלט מPhenoRipper הוא בעיקר השוואה היחסית של דפוסי הקרינה על פני תנאי ניסוי. אם אפיון מוחלט של תכונת תא בודדת ספציפית נדרש במקום (לדוגמא מספר הכתמים בתא), יידרש-מבוסס תא בודד ניתוח. עם זאת, גם בסוג זה של מצב, PhenoRipper עשוי לזהות שינויים בפנוטיפים תא בודד האלה, ולכן להיות כלי שימושי עבור opti assaymization.
Protocol
Representative Results
Discussion
זרימת העבודה המתוארת כאן מאפשרת אפיון והשוואה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים וקל. אנחנו הראשונים הוכיחו עד כמה זרימת עבודה זו יכולה לעזור אופטימיזציה של ניסוי, למשל על ידי ביצוע בקרת איכות במהירות בתמונות במיקרוסקופ. בשלב בא, שהראינו את הפוטנציאל שלה לניתוח נתונים הק?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאדם קוסטר וכל חברים האחרים של מעבדות אלטשולר והוו לקבלת משוב ודיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01 GM085442 וCA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), וולטש קרן I-1619 (SJA) ואני-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
Riferimenti
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
