Микрореология частиц отслеживания может быть использован для неразрушающего количественного и пространственно карту изменений в внеклеточного матрикса механических свойств в 3D моделей опухолей.
Механический микросреда как было показано, действовать в качестве важнейшего регулятора поведения роста опухоли и сигнализации, которая сама отремонтирован и модифицированной в рамках набора сложных, двусторонняя механочувствительных взаимодействий. В то время как развитие биологически-соответствующих 3D моделей опухолевых способствовали механистические исследования о влиянии матрицы реологических на рост опухоли, обратная задача изменения отображения в механической среде, вызванной опухолями остается сложной. Здесь мы описываем реализацию частиц отслеживания микрореологические (PTM) в сочетании с 3D моделями рака поджелудочной железы в рамках надежной и жизнеспособной подхода для продольно мониторинга физические изменения в опухоли микроокружения, на месте. Описываемая здесь методология интегрирует систему подготовки в пробирке 3D модели, внедренные в модели внеклеточного матрикса (ECM) лесов из типа I коллагена с флуоресцентной меченые зонды, равномерно распределенное для роsition-и нестационарные измерения микрореология всей образца. опухоли в искусственных условиях высевают и исследовали в параллельных условиях с использованием многоямного рентгенографические пластины. Опираясь на установленных методов, видео трассирующих движений зонда превращаются через отношение Обобщенная Стокса Эйнштейна (GSER) представить сложную частотно-зависимого модуля сдвига вязкоупругая, G * (ω). Потому что такой подход является визуализация на основе механической характеристики также отображается на больших передается освещенности пространственных областях одновременно сообщить качественные изменения в 3D размера опухоли и фенотипа. Представитель результаты, показывающие контрастные механическую ответ в субрегионов, связанных с локализованным вторжения вызванной деградации матрицы, а также калибровки системы, данные по валидации представлены. Нежелательные результаты от общих экспериментальных ошибок и устранения неисправностей этих вопросов также представлены. 96-а 3D формате культура покрытие реализованы в этом протоколе есть сonducive соотношению измерений микрореология с терапевтическими скрининга или молекулярной визуализации, чтобы получить новое понимание влияния лечения или биохимических раздражителей на механической микросреды.
Как видно из растущего организма доказательств в литературе, что раковые клетки, как и доброкачественных эпителиальных клетках млекопитающих, очень чувствительны к механическим и биофизических свойств окружающей внеклеточного матрикса (ECM) и других компонентов микроокружения 1-9. Элегантные механистические исследования предоставили понимание роли внеклеточной жесткости как сложной механочувствительных партнера сигнализации, которая регулирует злокачественную поведение роста и морфогенеза 2,3,10,11. Эта работа была облегчена, в частности, развития 3D в пробирке опухолевых моделях, которые восстанавливают биологически соответствующую архитектуру ткани и могут быть выращены в каркасных материалов с перестраиваемой механики и отображаемого с помощью оптической микроскопии 12-19. Однако, с другой стороны этого mechanoregulatory диалога между опухолью и микросреды, через который раковые клетки в свою очередь изменяет реологические свойства их окружения, остается несколькотруднее учиться. Например, во время нашествия процессов, клетки на периферии опухоли могут претерпевать эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и увеличения экспрессии матриксных металлопротеаз (ММР), которые вызывают местный деградацию внеклеточного матрикса 20-22, который, в свою очередь, влияет на поведение механочувствительных роста другие проксимальных опухолевые клетки. С помощью различных биохимических процессов, раковые клетки непрерывно набрать местную жесткость окружающей их среды вверх и вниз в соответствии с различными процессами в разное время. Описываемая здесь методология мотивируется необходимостью аналитических инструментов, которые сообщают местные изменения в жесткости и соответствия ЕСМ в процессе роста, которые могут быть интегрированы с 3D моделей опухоли и коррелирует продольно биохимических и фенотипических изменений, не выключая культуру.
В поисках подходящей техники для реализации в этом контексте, частица отслеживания микрореология (PTM) выступает как сильного кандидата.Этот метод, впервые первоначально Мейсон и Вайц 23,24, использует движение трассирующих зондов, встроенных в комплексной жидкости сообщить комплексный модуль частотно-зависимого сдвига вязкоупругая, G * (ω) при длине микронных масштабах. Этот общий подход был разработан с несколькими вариациями подходят для различных применений в мягких конденсированных сред, коллоидов, биофизики и физики полимеров 25-31. PTM имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами, так как показания местного вязкоупругости предоставляются неразрушающего видео визуализации биохимически неактивных меченых зондов, которые включены в момент подготовки культуры и оставаться на месте в течение продолжительных периодов роста. Это в отличие от золота стандартных измерений с колебательной сдвига объемной реометре, который обязательно требует прекращения культуры и сообщает объемную макроскопического реологические свойства образца, а не точечных измерений в рамках комплексной 3D опухоли microenvirютере. Действительно ряд исследований показано полезность интерпретации измерения движений трассирующими зонда в или вокруг раковых или не раковых клеток для измерения деформации, связанные с клеточной миграции 32, механическим нагрузкам, вызванной расширяющейся сфероида 33, внутриклеточного реологии 34,35, и для сопоставления механических напряжений и деформаций в инженерных тканей 36 и соотношение между размером пор и скорости вторжения 37. Другие методы, подходящие для микрореологические, такие как атомно-силовой микроскопии (АСМ) может быть реализован, но, прежде всего, для зондирования точки на поверхности образца, а также может представлять проблемы стерильности культуры, которые усложняют продольные измерений 38.
Здесь мы описываем комплексный протокол, охватывающий методы для роста 3D опухолевых сфероидов, пригодных для передачи в ECM со встроенными флуоресцентных зондов для видео частиц отслеживания и анализа методов надежно отображения пространственныеизменения в микрореологические с течением времени в культуре. В текущей реализации, модели 3D опухолевые выращивают в многоямного формате с целью к включению измерений микрореология с другими традиционными анализами (например, цитотоксичность), которые этот формат способствует. В этом представительного иллюстрации данной методики мы, в культуре пробирке 3D сфероидов с использованием PANC-1 клетки, установлено, линия поджелудочной железы раковые клетки, как известно, образуют сфероидов 39, но все измерения, описанные здесь, могут широко применяться для изучения солидных опухолей с использованием различных клеточных линий подходит для 3D культуры. Поскольку этот метод по своей сути визуализации на основе он идеально подходит для совместного регистрации микрореология данных высокого разрешения с большими передается-световых полей зрения, которые сообщают изменения в клеточного роста, миграции и фенотипа. Осуществление PTM интегрирована с передаваемой световой микроскопии таким образом предполагает, воспроизводимое позиционирование микроскопа стадии Whич как правило, доступны на моторизованных коммерческий Widefield эпифлуоресцентной биологических микроскопов. Протокол, разработанный ниже, могут быть реализованы с любым разумно оборудованный автоматизированный флуоресценции биологического микроскопа. Само собой, это данные с интенсивным методом, который требует получения гигабайт цифровых данных видео микроскопии для автономной обработки.
В следующем протоколе Протокол 1 относится к первоначальной подготовки опухолевых сфероидов, который описанных здесь с помощью наложения на агарозе но могут быть замещены различными другими способами, такими как висит капли 40 или 41 поворотного культуры методов. Протокол 2 описывает процесс встраивания сфероидов в коллагеновой строительные леса, хотя в качестве альтернативы, в пробирке 3D опухоли могут быть выращены инкапсуляции или вложения ресуспендировали клеток в ECM 12,15, а не отдельных предварительно сформированных неадгезивных сфероидов. Последующие протоколы описывают процедуры для Øbtaining временным разрешением измерения микрореология путем приобретения и обработки данных видео микроскопии, соответственно. Обработка данных описывается с помощью MATLAB, используя процедуры с открытым исходным кодом для PTM построен на алгоритмах первоначально описанных Крокер и Грира 42, который также широко развитой для различных программных платформ (см. http://www.physics.emory.edu/ ~ недели / IDL /).
В этом протоколе введем надежную и широко применимый стратегию продольно отслеживания локальные изменения в ECM жесткости в моделях 3D опухолей. Мы предполагаем, что эта методология может быть принят рака биологов и биофизиков, заинтересованных в механочувствительных поведения, причас…
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем глубокую признательность обмена с открытым исходным кодом от MATLAB частиц отслеживания код, предоставляемый Мария Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), наряду с ранее кода IDL и обширной документации, представленной John C. Крокер и Эрика Р. недель. Эта работа стала возможной благодаря финансовой поддержке Национального института рака (NCI / NIH), K99CA155045 и R00CA155045 (PI: СКП).
Bovine type 1 collagen | BD Biosciences, San Jose, California | 354231 | |
PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | or other appropriate cell type |
Fluorescent Microspheres | Life Technologies, Carlsbad, California | 906906 | |
Matrigel | BD Biosciences, Bedford MA | 354230 | |
Agarose | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | C12H18O9 | |
NaOH | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | NC0480985 | |
96-well Imaging plates | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | or appropriate cell culture media |
Zeiss AxioObsever Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | includes high-speed camera and imaging software | |
MATLAB software | The Mathworks, Natick, MA |