Längsgående Mätning av extracellulär matrix Stelhet i 3D tumörmodeller Använda Partikel-tracking Microrheology

Summary

Partikel-tracking microrheology kan användas för icke-destruktivt kvantifiera och rumsligt kartlägga förändringar i extracellulära matrix mekaniska egenskaper i 3D tumörmodeller.

Abstract

Den mekaniska mikromiljö har visat sig fungera som en viktig regulator av tumörtillväxt beteende och signalering, som själv är ombyggda och ändras som en del av en uppsättning av komplexa, tvåvägs mechanosensitive interaktioner. Medan utvecklingen av biologiskt relevanta 3D tumörmodeller har underlättat mekanistiska studier om effekterna av matris reologi på tumörtillväxt, det omvända problemet med kartläggning förändringar i den mekaniska miljön induceras av tumörer är fortsatt utmanande. Här beskriver vi genomförandet av partikel-tracking microrheology (PTM) tillsammans med 3D-modeller av cancer i bukspottskörteln som en del av en robust och livskraftig strategi för längs övervakning av fysiska förändringar i tumörens mikromiljö, in situ. Den metod som beskrivs här integrerar ett system för beredning av in vitro-3D-modeller inbäddade i en modell extracellulär matrix (ECM) byggnadsställning av typ I-kollagen med fluorescerande prober jämnt fördelade för ponings-och tidsberoende microrheology mätningar i hela provet. In vitro-tumörer är pläterade och sonderas i parallella förhållanden med hjälp av multispot avbildningsplattor. Rita på etablerade metoder, är videor av spårsondrörelser omvandlas via det allmänna Stokes Einstein Relation (GSER) att rapportera den komplexa frekvensberoende viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω). Eftersom detta tillvägagångssätt är imaging-baserade, är mekanisk karakterisering också avbildas på stora genomlysnings rumsliga områden att samtidigt rapportera kvalitativa förändringar i 3D tumörstorlek och fenotyp. Representativa resultat som visar kontrasterande mekanisk respons i delregioner i samband med lokal invasion-inducerad matrisnedbrytning samt systemkalibrering, är valideringsdata presenteras. Oönskade resultat från vanliga experimentella fel och felsökning av dessa frågor presenteras också. Den 96-väl 3D kultur plätering format förs i detta protokoll är conducive till korrelation av microrheology mätningar med terapeutiska screeninganalyser eller molekylär avbildning för att få nya insikter i effekten av behandlingar eller biokemiska stimuli på den mekaniska mikromiljö.

Introduction

Det framgår av en växande mängd bevis i litteraturen att cancerceller, som med icke-maligna däggdjurs epitelceller, är mycket känsliga för de mekaniska och biofysikaliska egenskaper hos den omgivande extracellulära matrix (ECM) och andra mikrokomponenter ^1-9. Elegant mekanistiska studier har gett insikter om betydelsen av extracellulärt styvhet som en komplex mechanosensitive partner signalsystem som reglerar malign tillväxt beteende och morfogenes ^2,3,10,11. Detta arbete har underlättats särskilt genom utvecklingen av 3D in vitro tumörmodeller som åter biologiskt relevant vävnadsarkitektur och kan odlas i ställningsmaterial med avstämbara mekanik och avbildas genom optisk mikroskopi ^12-19. Men den andra sidan av denna mechanoregulatory dialog mellan tumör och mikromiljö, varigenom cancerceller i sin tur modifiera reologin hos omgivningen, är fortfarande någotsvårare att studera. Till exempel, under invasionsprocesser får cellerna vid periferin av en tumör genomgå epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och öka uttryck av matrix-metalloproteaser (MMP: er) som orsakar lokal nedbrytning av ECM ^{20 till 22,} vilket i sin tur påverkar mechanosensitive tillväxtbeteende andra proximala tumörceller. Genom olika biokemiska processer, cancerceller ringa kontinuerligt den lokala styvhet sin miljö upp och ner för att passa olika processer vid olika tidpunkter. Den metod som beskrivs här motiveras av behovet av analytiska verktyg som rapporterar lokala förändringar i styvhet och efterlevnad av ECM under tillväxt, som kan integreras med 3D-tumörmodeller och korrelerade längsled med biokemiska och fenotypiska förändringar utan att avsluta kulturen.

På jakt efter en lämplig teknik för att genomföra i detta sammanhang, partikel-tracking microrheology (PTM) framstår som en stark kandidat.Denna metod, pionjärer ursprungligen av Mason och Weitz ^23,24, använder rörelse spår sonder inbäddade i en komplex vätska för att rapportera frekvensberoende komplex viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω) i micron längdskalor. Denna allmänna strategi har utvecklats med flera varianter anpassade för olika tillämpningar i mjuk-kondenserad materia, kolloider, biofysik och polymerfysik ^25-31. PTM har vissa fördelar i förhållande till andra metoder, eftersom avläsning av lokal viskoelasticitet tillhandahålls av icke-förstörande video avbildning av biokemiskt inaktiva spår sonder som är införlivade i samband med kultur förberedelser och förblir på plats under längre perioder av tillväxt. Detta står i kontrast till guldstandardmått med en oscillerande skjuvning bulk rheometer, som med nödvändighet kräver uppsägning av kultur och redovisar den delen makroskopisk reologi av provet istället punktmätningar inom komplexet 3D tumören microenvirjön. I själva verket ett antal studier har visat på nyttan av att tolka mätningar av spårsondrörelser i eller kring cancer eller icke-cancerceller för att mäta deformationer i samband med cellmigration ^32, mekanisk stress som en expanderande spheroid ^33, intracellulär reologi ^34,35, och att kart mekaniska påfrestningar i iscensatte silkespapper ^36, och förhållandet mellan porstorlek och invasion hastighet ^37. Andra tekniker som är lämpliga för microrheology, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) kan genomföras, men främst för att sondera punkter på provytan och även kan innebära kultur sterilitet frågor som försvårar längsgående mått ^38.

Här beskriver vi ett omfattande protokoll omfattar metoder för tillväxt av 3D tumör spheroids lämpliga för överföring till ECM med inbäddade fluorescerande prober för video partikel-tracking-och analysmetoder för tillförlitligt kartlägga rumsligaförändringar i microrheology över tiden i kultur. I föreliggande implementering, är 3D-tumörmodeller vuxit i multispot-format med utsikt mot inkorporering av microrheology mätningar med andra traditionella analyser (t.ex. cytotoxicitet) som detta format bidrar till. I detta representativa exempel på denna metod vi kultur in vitro 3D spheroids använder PANC-1-celler, en etablerad pankreascancer cellinje kända för att bilda sfäroider ^39, men alla mätningar som beskrivs här är brett tillämpbar för att studera av solida tumörer med hjälp av olika cellinjer lämpliga för 3D-kultur. Eftersom denna metod är till sin natur imaging-baserade den är idealisk för samtidig registrering av högupplösta microrheology uppgifter med stora genomlysnings synfält som rapporterar förändringar i celltillväxt, migration och fenotyp. Genomförandet av PTM integrerat med genomlysning mikroskopi på detta sätt antar reproducerbar placering av mikroskop scenen which är vanligtvis tillgänglig på motordrivna kommersiell widefield epifluorescence biologiska mikroskop. Protokollet utvecklades nedan kan genomföras med någon rimligen utrustade automatiserad fluorescens biologiska mikroskop. Detta är en inneboende dataintensiv metod, som kräver förvärv av gigabyte digital video mikroskopi data för offline bearbetning.

I följande protokoll, protokoll 1 avser den inledande beredningen av tumör sfäroider som beskrivs här med hjälp av overlay på agaros men kan ersättas med en mängd andra metoder såsom hängande droppe ^40, eller roterande kultur ⁴¹ tekniker. Protokoll 2 beskriver processen att bädda spheroids i en kollagenbyggnadsställning men alternativt kan in vitro 3D tumörer odlas genom inkapsling eller inbäddning av suspenderade celler i ECM ^12,15, snarare än enstaka förformade icke-vidhäftande sfäroider. Efterföljande protokoll beskriver förfaranden för obtaining tidsupplösta microrheology mätningar genom att förvärva och behandla videomikroskopi data, respektive. Databehandling beskrivs med hjälp av MATLAB, att använda sig av öppen källkod rutiner för PTM bygger på algoritmer som ursprungligen beskrevs av Crocker och Grier ^42, som har också i stor utsträckning utvecklats för olika mjukvaruplattformar (se http://www.physics.emory.edu/ ~ veckor / IDL /).

Protocol

1. Odling Tumör spheroids Blanda 10 ml av cellodlingskvalitet vatten med 0,1 g agaros för att erhålla en 1% agaros-lösning. Värme agaroslösningen till över 70 ° C (ungefär 14 sek i en vanlig mikrovågsugn eller genom användning av en värmeplatta) före alikvotering av 40 pl av agaroslösningen i en brunn på en 96-brunnars platta. Inkubera plattan vid 37 ° C under minst en timme medan skörda cellerna med användning av standardtekniker. Använd en hemacytometer för …

Representative Results

För att kontrollera giltigheten av G * (ω) mätningar vid lokala positioner inom en komplex modell tumormicroenvironmenten ades två inledande validering experiment. Först sökte vi att validera våra mätningar mot den "gyllene standarden" för bulk oscillerande skjuvning reometri. Vi förberedde identiska prover av kollagenmatrisen (utan celler) i en koncentration av 1,0 mg / ml kollagen. Dessa prover undersöktes med en bulk reometer (TA Instruments AR-G2, med användning av 40 mm parallell plat…

Discussion

I detta protokoll introducerar vi en robust och brett tillämpbar strategi för längs spåra lokala förändringar i ECM styvhet i 3D tumörmodeller. Vi ser framför oss att denna metod skulle kunna antas av cancerbiologer och biophysicists intresserade mechanosensitive uppträdande blandas in i matrix remodellering vid tumörtillväxt och invasion processer. Exakt kvantifiering av matrisnedbrytnings kinetiken kan vara särskilt värdefull för de som studerar aktiviteten av matrismetallproteaser, lysyloxidas eller and…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA