Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

Summary

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Abstract

La mecánica microambiente se ha demostrado que actúa como un regulador crucial del comportamiento de crecimiento del tumor y de señalización, que es en sí remodelado y modificadas como parte de un conjunto de, interacciones de dos vías mechanosensitive complejos. Si bien el desarrollo de modelos de tumores en 3D biológicamente relevantes han facilitado estudios mecánicos sobre el impacto de la reología de la matriz en el crecimiento del tumor, el problema inverso de la cartografía de los cambios en el entorno mecánica inducida por tumores sigue siendo un reto. Aquí, se describe la aplicación de partículas de seguimiento de microrheology (PTM) en conjunción con modelos 3D de cáncer de páncreas como parte de un enfoque sólido y viable para el seguimiento longitudinalmente cambios físicos en el microambiente del tumor, in situ. La metodología descrita aquí se integra un sistema de preparación in vitro en modelos 3D incrustados en un modelo de matriz extracelular (ECM) andamio de colágeno de tipo I con sondas marcadas con fluorescencia distribuidos de manera uniforme para POsición y mediciones microrheology dependientes del tiempo a lo largo de la muestra. tumores in vitro están chapados y probaron en condiciones paralelas utilizando placas de imagen de múltiples pocillos. Sobre la base de los métodos establecidos, videos de los movimientos de la sonda de rastreo se transforman a través de la Relación Generalizado Stokes Einstein (GSER) para reportar el módulo de cizallamiento complejo viscoelástico dependiente de la frecuencia, G * (ω). Debido a que este enfoque es a base de formación de imágenes, caracterización mecánica también se proyecta sobre grandes campos espaciales de luz transmitida a reportar simultáneamente cambios cualitativos en el tamaño del tumor 3D y fenotipo. Los resultados representativos que muestran contraste respuesta mecánica en sub-regiones asociadas con degradación de la matriz localizada inducida por invasión-, así como la calibración del sistema, se presentan los datos de validación. También se presentan los resultados no deseados de los errores experimentales comunes y solución de problemas de estos temas. El formato de chapado cultura 3D de 96 bien implementado en este protocolo es conducive a la correlación de las mediciones microrheology con ensayos de cribado terapéuticos o de imagen molecular para obtener nuevos conocimientos sobre el impacto de los tratamientos o estímulos bioquímicos en el microambiente mecánico.

Introduction

Pues bien, de un creciente cuerpo de evidencia en la literatura que las células cancerosas, al igual que las células epiteliales de mamíferos no malignas, son muy sensibles a las propiedades mecánicas y biofísicas de la matriz extracelular circundante (ECM) y otros componentes del microambiente ^1-9. Estudios mecánicos elegantes han proporcionado ideas sobre el papel de la rigidez extracelular como socio de señalización mechanosensitive complejo que regula el comportamiento maligno de crecimiento y la morfogénesis ^2,3,10,11. Esta labor se ha visto facilitada en particular, por el desarrollo del 3D en modelos tumorales in vitro que restauran la arquitectura del tejido biológicamente relevante y se pueden cultivar en materiales de andamiaje con la mecánica sintonizables y imágenes de microscopía óptica ^12-19. Sin embargo, el otro lado de este cuadro de diálogo mechanoregulatory entre el tumor y el microambiente, a través del cual las células cancerosas, a su vez modificar la reología de su entorno, sigue siendo algomás difíciles de estudiar. Por ejemplo, durante los procesos de invasión, las células en la periferia de un tumor pueden someterse a transición epitelial a mesenquimal (EMT) y aumentar la expresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs) que causan la degradación local de la ECM ^20-22, que a su vez influye en el comportamiento de crecimiento de mechanosensitive otras células tumorales proximal. A través de una variedad de procesos bioquímicos, células de cáncer de marcar continuamente la rigidez local de su entorno arriba y hacia abajo para adaptarse a diferentes procesos en diferentes momentos. La metodología descrita aquí está motivada por la necesidad de instrumentos de análisis que reportan los cambios locales en la rigidez y el cumplimiento de la MEC durante el crecimiento, que se pueden integrar con modelos de tumores en 3D y correlacionados longitudinalmente con cambios bioquímicos y fenotípicas sin interrumpir la cultura.

En busca de una técnica apropiada para aplicar en este contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) se perfila como un fuerte candidato.Este método, pionero originalmente por Mason y Weitz ^23,24, utiliza el movimiento de las sondas de rastreo incrustados en un fluido complejo reportar el módulo complejo dependiente de la frecuencia de cizalla viscoelástico, G * (ω) a escalas de longitud de micras. Este enfoque general ha sido desarrollado con múltiples variaciones adecuadas para diferentes aplicaciones en-suaves de la Materia Condensada, coloides, la biofísica y la física de polímeros ^25-31. PTM tiene ciertas ventajas con respecto a otros métodos, ya que las lecturas de la viscoelasticidad local son proporcionados por formación de imágenes de vídeo no destructivo de las sondas de trazador bioquímicamente inactivos que se incorporan en el momento de preparación de cultivo y permanecen en su lugar durante largos períodos de crecimiento. Esto está en contraste con las medidas estándar de oro con un reómetro de cizalla oscilatoria a granel, lo que necesariamente requiere la terminación de la cultura y de los informes de la reología macroscópica grueso de la muestra en lugar de mediciones puntuales dentro del complejo microenvir tumor 3DAMBIENTE. De hecho, un número de estudios han demostrado la utilidad de la interpretación de las mediciones de movimientos de la sonda trazador en o alrededor de las células cancerosas o no cancerosas para medir deformaciones asociadas con la migración celular ^32, la tensión mecánica inducida por un esferoide expansión ^33, reología intracelular ^34,35, y para asignar cargas mecánicas en la ingeniería de tejidos ^36, y la relación entre el tamaño de los poros y la velocidad de invasión ^37. Otras técnicas adecuadas para microrheology, tales como la microscopía de fuerza atómica (AFM) se pueden implementar, pero principalmente para sondear los puntos en la superficie de la muestra y también pueden plantear problemas de esterilidad de la cultura que complican las mediciones longitudinales ^38.

Aquí se describe un protocolo integral métodos para el crecimiento de esferoides tumorales 3D adecuados para su transferencia a ECM con sondas fluorescentes incrustados para vídeo partícula de seguimiento y análisis de métodos para mapear fiablemente espacial que abarcacambios en microrheology largo del tiempo en la cultura. En la presente aplicación, modelos de tumores 3D se cultivan en formato de múltiples pocillos con vistas a la incorporación de mediciones microrheology con otros ensayos tradicionales (por ejemplo, citotoxicidad) que este formato es propicio para. En esta ilustración representativa de esta metodología de cultivo in vitro esferoides 3D utilizando células PANC-1, una línea celular de cáncer de páncreas establecidos conocidos para formar esferoides ^39, pero todas las mediciones descritas en este documento son ampliamente aplicables al estudio de tumores sólidos usando una variedad de líneas celulares adecuados para el cultivo en 3D. Debido a que este método se basa formación de imágenes de sí que es ideal para el co-registro de los datos microrheology alta resolución con grandes campos de luz transmitida de vista que informan de cambios en el crecimiento celular, la migración y el fenotipo. La implementación de PTM integrado con microscopía de luz transmitida de esta manera asume el posicionamiento reproducible de los qu platina del microscopioich suele estar disponible en los microscopios biológicos epifluorescencia widefield comercial motorizados. El protocolo desarrollado a continuación se puede implementar con cualquier microscopio biológico de fluorescencia automatizado razonablemente equipadas. Este es un método intensivo de datos inherente, lo que requiere la adquisición de gigabytes de datos de microscopía de vídeo digitales para el procesamiento fuera de línea.

En el siguiente protocolo, Protocolo 1 se refiere a la preparación inicial de esferoides tumorales que se describe aquí el uso de superposición en agarosa, pero podría estar sustituidos con una variedad de otros métodos tales como la gota que cuelga ^40, o cultivo rotatorio ⁴¹ técnicas. Protocolo 2 se describe el proceso de integración de esferoides en una estructura de colágeno, aunque, alternativamente, in vitro tumores en 3D podrían ser cultivadas mediante encapsulación o la incrustación de células resuspendidas en ECM ^12,15, en lugar de esferoides no adherentes individuales pre-formadas. Protocolos posteriores describen procedimientos para obtaining mediciones microrheology tiempo de resolverse mediante la adquisición y procesamiento de datos de microscopía de vídeo, respectivamente. El procesamiento de datos se describe utilizando MATLAB, haciendo uso de las rutinas de código abierto para el PTM construido en algoritmos descritos originalmente por Crocker y Grier ^42, que también se han desarrollado ampliamente para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semana / idl /).

Protocol

1. Esferoides tumorales cultivo Mezclar 10 ml de agua de grado de cultivo de células con 0,1 g de agarosa para obtener una solución de agarosa al 1%. Solución de agarosa de calor por encima de 70 ° C (más o menos 14 segundos en un horno de microondas estándar o mediante el uso de una placa de calentamiento) antes de alícuotas de 40 l de solución de agarosa en un pocillo en una placa de 96 pocillos. Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 h mientras la cosecha de las células …

Representative Results

Para verificar la validez de G * (ω) mediciones en las posiciones localizadas dentro de un complejo microambiente tumoral modelo, se realizaron dos experimentos iniciales de validación. En primer lugar, hemos tratado de validar nuestras medidas contra el "estándar de oro" de reometría cizalla oscilatoria granel. Hemos preparado muestras idénticas de matriz de colágeno (sin células) a una concentración de 1,0 colágeno mg / ml. Estas muestras se probaron con un reómetro mayor (TA Instruments A…

Discussion

En este protocolo se introduce una estrategia sólida y de aplicación general para el seguimiento longitudinal cambios locales en la rigidez ECM en modelos de tumores en 3D. Tenemos la visión de que esta metodología podría ser adoptada por los biólogos del cáncer y biofísicos interesados ​​en el comportamiento mechanosensitive implicados en la remodelación de la matriz durante el crecimiento del tumor y de los procesos de invasión. La cuantificación precisa de la cinética de degradación de la matriz podr…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA