استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن
Summary
يمكن أن تقنيات الاستشعار البيولوجي البصرية الكشف عن التغييرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما في الخلايا الحية وتسمح لأحد أن يتبع الاستجابات الخلوية في كل من الخلايا الفردية والسكان الخلايا. ووصف هذا البروتوكول الكشف عن التشكيل قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات في خلايا سليمة إلى جانب استخدام هذا النهج.
Abstract
القنوات الأيونية سيطرة على الخواص الكهربائية للخلايا العصبية وغيرها من أنواع الخلايا منفعل من خلال السماح بشكل انتقائي الأيونات في التدفق من خلال غشاء البلازما 1. لتنظيم استثارة الخلايا العصبية، يتم تعديل خصائص الفيزيائية الحيوية من القنوات الأيونية التي كتبها إشارات البروتينات والجزيئات، والتي غالبا ما ربط قنوات أنفسهم لتشكيل مغايرة التغصن 2،3 معقدة القناة. المقايسات التقليدية دراسة التفاعل بين القنوات والبروتينات التنظيمية تتطلب تسميات الخارجية التي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف، مع توفير القليل من المعلومات على مسار وقت التفاعلات في الخلايا الحية. أجهزة الاستشعار البصرية، مثل نظام X-هيئة العلوم البيولوجية BIND سكانر، استخدام خالية من التسمية التكنولوجيا الرواية، صدى الطول الموجي صريف (RWG) أجهزة الاستشعار البصرية، للكشف عن تغيرات في الرنانة الضوء المنعكس بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي. يسمح هذا الفحص الكشف عن النسبيةتغيير في كتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الحية تمسكا سطح جهاز الاستشعار البيولوجي الناتجة عن التغيرات التي يسببها يجند في التصاق الخلية والانتشار، سمية، والانتشار، والتغيرات في البروتين البروتين التفاعلات بالقرب من غشاء البلازما. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار البصرية RWG للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، مستقبلات التيروزين كيناز، وغيرها من مستقبلات سطح الخلية. ويمكن أيضا التغييرات التي يسببها يجند في أيون قناة البروتين التفاعلات دراستها باستخدام هذا الاختبار. في هذه الورقة، فإننا سوف تصف إجراء التجارب المستخدمة للكشف عن التشكيل من سلاك-B-تنشيط الصوديوم والبوتاسيوم (K نا) القنوات بواسطة GPCRs.
Introduction
دراسة الخلايا الحية في سياقها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أمر حاسم لفهم الوظائف البيولوجية للأهداف الخلوية. ومع ذلك، المقايسات دراسة التفاعل بين القنوات وبروتينات حشوية التنظيمية، مثل فحوصات coimmunoprecipitation، وتوفير عموما القليل من المعلومات على مدار الساعة من التفاعلات في الخلايا الحية. غالبية المقايسات خلية مقرها الحالي قياس حدثا الخلوية محددة، مثل إزفاء من البروتين الموسومة fluorescently من الفائدة. هذه المقايسات تتطلب إدخال تعديلات على البروتينات المثيرة للاهتمام، والتي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف. المقايسات خلية مقرها موسع، والتي لا تتطلب التلاعب في النظام، وتوفير القياس المستمر من النشاط الخلوي والسماح للخلايا في الدراسات الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الدولة 4.
تم تصميم أجهزة الاستشعار البصرية لإنتاجتغيير قابلة للقياس في سمة من الضوء الذي يترافق إلى السطح الاستشعار. أجهزة الاستشعار البصرية التي تستخدم موجات زائل، والتي تشمل سطح مأكل صدى (SPR) والطول الموجي صدى صريف (RWG) التقنيات، وقد استخدمت في المقام الأول للكشف عن الانتماءات وحركية جزيئات ملزم لمستقبلات بيولوجية عن أداء وظائفها على سطح جهاز الاستشعار. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة الاستشعار المتاحة تجاريا RWG للسماح للكشف عن التغير النسبي في الكتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الملتصقة على سطح مستشعر بدقة مكانية عالية (تصل إلى 3.75 ميكرون / بكسل) 5. ويمكن لهذه التغييرات في أجهزة الاستشعار كشف جماعية بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا الحية التي تنتج عن التحفيز، مثل التصاق الخلية والانتشار، سمية وانتشارها ومسارات الإشارات التي تسببها مجموعة متنوعة من مستقبلات سطح الخلية بما في ذلك G-البروتين مستقبلات جانب (GPCRs) 6 . أجهزة الاستشعار RWG كشف تشان النسبيةجنرال الكتريك في مؤشر الانكسار بوصفها وظيفة من التغير النسبي في الكتلة ضمن 150 نانومتر من جهاز الاستشعار البيولوجي 7. عندما ومطلي الخلايا إلى جهاز الاستشعار البيولوجي، وهذا التغير في الرقم القياسي للانكسار يعكس التغير في كتلة بالقرب من غشاء البلازما الخلية الناتجة عن التغير في الانضمام الخليوي الى جهاز الاستشعار البيولوجي. وهذا البروتوكول مناقشة الكشف عن التفاعلات قناة البروتين باستخدام أجهزة الاستشعار RWG.
تتكون مجموعة العمل الخاصة باللاجئين أنظمة الحصول على البيانات من عدة مكونات. لأن X-هيئة العلوم البيولوجية BIND الماسح الضوئي كان يستخدم لهذه التجارب، ونحن يجب الرجوع إلى مكونات هذا النظام على وجه الخصوص، والذي يتألف من قارئ لوحة، أجهزة الاستشعار المرتبطة بها، BIND المسح الضوئي البرمجيات الاستحواذ، وبرامج التحليل BIND عرض 8. وأجهزة الاستشعار الضوئية الكريستال، ويشار إليه فيما بعد أجهزة الاستشعار البصرية و، وتتكون من ترتيب الدوري لعازلة والمادية في 2 أو 3 أبعاد والذي يحول دون انتشار الضوء في محددةموجات والاتجاهات. وتستند هياكل الكريستال الضوئية على ظاهرة تسمى شذوذ وود. اكتشفت لأول مرة من قبل وود في عام 1902، وهذه الحالات الشاذة هي الآثار التي لوحظت في طيف الضوء الذي ينعكس من خلال حواجز شبكية حيود البصرية حيث تحدث تغيرات سريعة في شدة سيما أوامر حيود في بعض نطاقات التردد ضيقة. في عام 1962، قدم هيسيل وOliner نظرية جديدة من الشذوذ وود التي صريف فترة محدودة يولد طول موجة الرنين مكانة 9. في أجهزة الاستشعار البصرية وصفها هنا، وتستخدم الشذوذ وود لإنتاج جهاز الاستشعار البيولوجي RWG أنه عندما حفز مع الضوء الأبيض يعكس سوى نطاق ضيق جدا من الأطوال الموجية (عادة بين 850-855 نانومتر).
تتكون أجهزة الاستشعار الفردية من مادة البلاستيك المنخفض مؤشر الانكسار مع هيكل سطح الدورية التي المغلفة بطبقة رقيقة من ثاني أكسيد عازلة مادة التيتانيوم عالية الانكسار (تيو 2). عندما biosensأو مضاءة مع مصدر ضوء طول موجي واسع، صريف البصرية من البلورات الضوئية ويعكس نطاق ضيق من موجات الضوء التي تقاس في معمل الماسح BIND. ثم يتم حساب كثافة ذروة موجات تنعكس (قمة الطول الموجي القيمة، أو PWV) من إشارة. وPWV من تحولات الضوء على تغيير في معامل الانكسار نتيجة لزيادة أو نقصان في كتلة داخل القرب (~ 150 نانومتر) من سطح جهاز الاستشعار البيولوجي. يتم دمج أجهزة الاستشعار البصرية الى جمعية القياسية للعلوم البيولوجية (SBS) صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا لالمقايسات المستخدمة في هذه التجارب.
وتستخدم أجهزة الاستشعار RWV للكشف عن التغييرات على إضافة الإشارات الخارجية في الخلايا الحية 10. ومثقف الخلايا مباشرة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي RWG ويتم مراقبة التغير في الرقم القياسي المحلي من الانكسار عند العلاج مع المثيرات محددة. اتجاه التغيير في الكتلة في جهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن يكونتحديد، لأن يقاس زيادة في المؤشر المحلي من نتائج الانكسار من زيادة في الكتلة بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي وحيث أن زيادة PWV. على العكس من انخفاض في كتلة تنتج انخفاضا في PWV. التغيير في الكشف عن PWV يمكن أن تنجم عن العديد من الأحداث الخلوية، بما في ذلك التغيرات في التصاق الخلية والبروتين التوظيف / الإفراج عنهم، الإلتقام وإعادة التدوير، إيماس، موت الخلايا المبرمج، وإعادة ترتيب هيكل الخلية. على سبيل المثال، يمكن فحص كشف عن تغيرات في التفاعلات قناة البروتين بين قنوات البوتاسيوم وغيرها من مكونات حشوية أو هيكل الخلية. هذا الحدث، ومع ذلك، يجب أن تحدث داخل منطقة الكشف نانومتر ~ 150 بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي، وفي حالة وجود الخلية المرفقة، بالقرب من غشاء البلازما. يتم تنفيذ اكتساب الاستجابات الخلوية مع BIND المسح الضوئي البرمجيات ويتم إنشاء تمثيل صورة كل من الآبار 384 في لوحة SBS. هذا النظام لديه دقة تصل الى 3.75 ميكرون / بكسل، مما يسمح للكشف عن الأحداث في زنازين انفرادية، ويمكن استخدامها إما مع خطوط الخلايا (مثل الخلايا أو HEK293 CHO) أو مع أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الخلايا الأولية. تحليل الصور مع BIND عرض البرنامج يسمح للكشف عن الاستجابات الخلوية في كل من الفرد والسكان من الخلايا. كما يتم دمج أجهزة الاستشعار في مستوى SBS 384 جيدا microplates، ونظام قابل للتكيف بسهولة لفحص عالية الإنتاجية (HTS).
وقد سبق استخدام الرنين طول الموجة أجهزة الاستشعار البصرية صريف للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل GPCRs 11. مختبرنا والمستنسخة اثنين من قنوات البوتاسيوم (K نا) تنشيط الصوديوم، سلاك-B والبقعة 12. وقد تبين أن نشاط كل القنوات سلاك-B والبقعة لتكون بقوة تتأثر التنشيط المباشر للبروتين كيناز C (PKC) 13. تفعيل البروتين Gα ف مستقبلات مزدوجة، مثل مستقبلات المسكارينية M1 وmGluR1 metabotropic الغلوتامات صeceptor، وينظم النشاط أكثر قدرة القناة من خلال تفعيل PKC. هذه القنوات K نا تسهم في التكيف العصبية خلال التحفيز المستمر وتنظيم دقة توقيت العمل إمكانات 14. ومن المعروف أن القنوات الركود للتفاعل مع مجموعة متنوعة من الجزيئات يشير حشوية، بما في ذلك FMRP، والهشة البروتين X التخلف العقلي 15،16. نتيجة طفرات في سلاك في ترحيل متعددة النوبات الجزئية من الطفولة (MMPSI)، وهو شكل بداية مبكرة من الصرع الذي ينتج تأخر في النمو الشديد 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
ى رئيس (Z ') عامل هو طريقة إحصائية موحدة لقياس نوعية عالية الإنتاجية الفرز مقايسة 20، ولأن الفرز للمنبهات GPCR في هذا الاختبار وقع في SBS متوافق فحص 384 جيدا، ويوفر ممتازة مقياس لقوة وصحة هذا الاختبار 21. قيمة من الألف إلى الياء "من 1 إلى مقايسة مثالية نظريا مع ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون للدكتور يانغ يانغ يان في مختبر الدكتور فريد Sigworth في جامعة ييل للتبرع السخي من الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت الفئران البروتين سلاك-B. وبالإضافة إلى ذلك الكتاب ممتنون للدكتور Sigworth عن البرد الإلكترون المجهري نموذج التماثل من سلاك عرض في مقدمة الفيديو. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DH067517 وNS073943 إلى LKK
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
Riferimenti
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
