El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Summary

Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque.

Abstract

Los canales iónicos controlan las propiedades eléctricas de las neuronas y otros tipos de células excitables al permitir selectivamente los iones fluyan a través de la membrana de plasma ^1. Para regular la excitabilidad neuronal, las propiedades biofísicas de los canales de iones son modificados por las proteínas y moléculas de señalización, que a menudo se unen a los propios canales para formar un complejo de ^2,3 canal heteromérico. Ensayos tradicionales que analizan la interacción entre canales y proteínas reguladoras requieren etiquetas exógenos que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta, mientras que proporciona poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. Biosensores ópticos, tales como el sistema X-CUERPO Biociencias BIND escáner, utilizan una nueva tecnología sin etiqueta, rejilla de longitud de onda de resonancia (GTR) biosensores ópticos para detectar cambios en el resonante luz cerca del biosensor reflejada. Este ensayo permite la detección de la relacióncambio en la masa dentro de la porción inferior de las células vivas adheridas a la superficie del biosensor como resultado de cambios inducidos ligando en la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación, y los cambios en las interacciones proteína-proteína cerca de la membrana plasmática. Biosensores ópticos GTR se han utilizado para detectar cambios en la masa cerca de la membrana de plasma de las células después de la activación de los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), los receptores de tirosina quinasas, y otros receptores de la superficie celular. Ligando los cambios inducidos en iones de interacciones proteína-canal también se pueden estudiar usando este ensayo. En este artículo, describiremos el procedimiento experimental utilizado para detectar la modulación de Slack-B de sodio y potasio activados (K _Na) canales de GPCR.

Introduction

El examen de las células vivas en su contexto fisiológicamente relevante es crucial para la comprensión de las funciones biológicas de las dianas celulares. Sin embargo, los ensayos que examinan la interacción entre canales y proteínas citoplasmáticas reguladoras, tales como ensayos coimmunoprecipitation, generalmente proporcionan poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. La mayoría de los ensayos basados ​​en células actuales medir un evento celular específico, tal como la translocación de una proteína marcado con fluorescencia de interés. Estos ensayos requieren modificaciones de las proteínas de interés, que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta. Ensayos basados ​​en células no invasiva, que no requieren la manipulación del sistema, proporcionan una medición continua de la actividad celular y permiten estudios de células en su estado más fisiológicamente relevante ^4.

Biosensores ópticos están diseñados para producirun cambio medible en una característica de la luz que está acoplada a la superficie del sensor. Biosensores ópticos que utilizan ondas evanescentes, que incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la resonancia de longitud de onda de rejilla (GTR) técnicas, se han utilizado principalmente de detectar las afinidades y la cinética de las moléculas de unión a sus receptores biológicos inmovilizados sobre la superficie del sensor. Más recientemente, los biosensores GTR disponibles comercialmente se han desarrollado para permitir la detección de la variación relativa de la masa dentro de la porción inferior de las células adherentes a la superficie del sensor a alta resolución espacial (hasta 3,75 m / píxel) ^5. Estos biosensores pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células vivas que resultan de la estimulación, tales como la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación y vías de señalización provocados por una variedad de receptores de la superficie celular, incluyendo los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) ⁶ . Biosensores GTR detectan la relación chanGE en el índice de refracción como una función de la variación relativa en masa dentro de 150 nm del biosensor ^7. Cuando las células se colocan en placas al biosensor, este cambio en el índice de refracción refleja el cambio en la masa cerca de la membrana plasmática de la célula resultante de un cambio en la adhesión celular para el biosensor. Este protocolo se discutirá la detección de interacciones proteína-canal utilizando biosensores GTR.

Los sistemas de adquisición de datos GTR constan de varios componentes. Debido a que el X-CUERPO Biociencias BIND escáner fue utilizado para estos experimentos, se hará referencia a los componentes de este sistema en particular, que consiste en un lector de placas, biosensores asociados, software de adquisición de BIND Scan y software BIND Ver análisis ^8. Los biosensores de cristal fotónico, nos referiremos en adelante como biosensores ópticos, están compuestos por un arreglo periódico de un dieléctrico y material en 2 o 3 dimensiones que impide la propagación de la luz en específicolongitudes de onda y las direcciones. Estructuras de cristal fotónico se basan en un fenómeno llamado anomalía de Wood. Descubierta por primera vez por Wood en 1902, estas anomalías son los efectos observados en el espectro de luz reflejada por las rejillas de difracción ópticas donde se producen variaciones rápidas en la intensidad de determinadas órdenes de difracción en ciertas bandas de frecuencia estrechas. En 1962, Hessel y Oliner presentan una nueva teoría de las anomalías de la madera en la que finita periodo de red genera una longitud de onda de resonancia de pie ^9. En los biosensores ópticos descritos aquí, anomalías de madera se utilizan para producir un biosensor GTR que cuando se estimula con luz blanca refleja sólo banda muy estrecha de longitudes de onda (típicamente entre 850 a 855 nm).

Biosensores individuales se componen de un material de bajo índice de refracción de plástico con una estructura superficial periódica que está recubierto con una fina capa de dióxido de titanio de material dieléctrico de alta refracción _(TiO2). Cuando los Biosenso se ilumina con una fuente de luz de longitud de onda, la rejilla óptica de los cristales fotónicos refleja un rango estrecho de longitudes de onda de luz que se mide mediante un espectrofotómetro en el escáner de BIND. La intensidad máxima de las longitudes de onda reflejadas (Longitud de onda máxima del valor, o la VOP) se calcula a partir de la señal. El VOP de la luz cambia a un cambio en el índice de refracción como resultado de un aumento o disminución de la masa dentro de la proximidad (~ 150 nm) de la superficie del biosensor. Biosensores ópticos se incorporan en un estándar de la Sociedad de Ciencias Biomoleculares (SBS) de microplacas de 384 pocillos para los ensayos utilizados en estos experimentos.

Biosensores RWV se utilizan para detectar cambios tras la adición de señales exógenas en las células vivas ^10. Las células se cultivan directamente sobre la superficie de un biosensor GTR y el cambio en el índice local de refracción se monitoriza tras el tratamiento con estímulos específicos. La dirección del cambio en la masa en el biosensor puede serdeterminado, debido a un aumento en el índice local de resultados de la refracción de un aumento de masa cerca del biosensor y se mide como un aumento de la VOP. Por el contrario una disminución de la masa produce una disminución de la VOP. El cambio en la VOP detectado puede ser el resultado de numerosos eventos celulares, incluyendo cambios en la adhesión celular, proteínas de reclutamiento / liberación, la endocitosis y el reciclaje, la exocitosis, la apoptosis y reordenamiento del citoesqueleto. Por ejemplo, el ensayo puede detectar cambios en las interacciones proteína-canal entre los canales de potasio y otros componentes citoplasmáticos o citoesqueleto. El evento, sin embargo, debe ocurrir dentro de la zona de detección nm ~ 150 cerca del biosensor, y en el caso de una celda adjunta, cerca de la membrana plasmática. Adquisición de las respuestas celulares se realizó con el software de BIND Scan y se genera una representación de la imagen de cada uno de los 384 pocillos en la placa de SBS. Este sistema tiene una resolución de hasta 3,75 m / píxel, que permite la detección de eventos en células individuales, yse puede utilizar tanto con líneas celulares (tales como células HEK293 o CHO) o con más fisiológicamente relevantes células primarias. El análisis de imágenes con el software de BIND Ver permite la detección de respuestas celulares, tanto en individual y poblaciones de células. Como los biosensores se incorporan en estándar SBS microplacas de 384 pocillos, el sistema es fácilmente adaptable a cribado de alto rendimiento (HTS).

Biosensores ópticos de rejilla de resonancia de longitud de onda se han usado previamente para detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células después de la activación de GPCR ^11. Nuestro laboratorio ha clonado dos canales de potasio de sodio activados (K _Na), Slack-B y Slick ^12. La actividad de ambos canales B-Slack y Slick ha demostrado ser muy fuertemente influenciada por la activación directa de la proteína quinasa C (PKC) ^13. La activación de los receptores acoplados a proteínas Gα _q, tales como el receptor muscarínico M1 y el mGluR1 metabotrópico de glutamato receptor, regula de forma potente la actividad del canal a través de la activación de PKC. Estos canales de K _Na contribuyen a la adaptación neuronal durante la estimulación sostenida y regular la exactitud de la sincronización de los potenciales de acción ^14. Canales de tensión se sabe que interactúan con una variedad de moléculas de señalización citoplasmáticas, incluyendo FMRP, la proteína de retraso mental X Frágil ^15,16. Las mutaciones en consecuencia Slack en múltiples Migración Convulsiones parciales de la infancia (MMPSI), una forma de aparición temprana de la epilepsia que se traduce en un retraso grave del desarrollo ^17.

Protocol

1. Cultivos Celulares (Adaptado de Fleming y Kaczmarek 18) Células de cultivo en medios apropiados para superior a 2 pero menos de 10 pasajes antes de su uso en este ensayo. Células no transfectadas HEK-293 y las células HEK-293 que expresan establemente la proteína de rata de parafina y-B se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco uno medio y uno medio de Leibovitz L-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y antibióticos. 500 g / ml de geneticina (G418) se…

Representative Results

Las células HEK-293 transfectadas Slack-B transfectadas establemente células HEK-293 y el control se sembraron a 1000 células / pocillo en 384 pocillos, recubiertos ECM GTR placas biosensores. Las imágenes de la central de 1,5 mm 2 del biosensor se registraron con una resolución de 3,75 m / píxel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidad de masa se generaron antes y 30 minutos después de la adición del compuesto con el software BIND Scan. El BIND Ver software se utilizó para determi…

Discussion

El primer Z (Z ') factor es un método estadístico común para cuantificar la calidad de un ensayo de cribado de alto rendimiento ^20, y porque la proyección de los agonistas de GPCR en este ensayo se produjo en un ensayo de 384 pocillos compatibles SBS, proporciona una excelente medida de la solidez y validez de este ensayo ^21. Valor AZ 'de 1 indica un ensayo teóricamente ideal, con un número infinito de puntos de datos con desviaciones estándar inexistentes. Valor AZ 'de entre 0,5…

Materials

DMEM, High Glucose	Life Technologies	11965-092
Leibovitz's L-15 Medium	Life Technologies	11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Geneticin G-418 Sulfate	American Bioanalytical	AB05057
HBSS	Life Technologies	14025-092
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Albumin from chicken egg white	Sigma-Aldrich	A5378
DPBS	Life Technologies	14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-6
Carbamoylcholine chloride	Sigma-Aldrich	C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt	Sigma-Aldrich	S8701
Finnpipette (5-50 µl)	Thermo Scientific	4662090
BIND Scanner System	X-BODY Biosciences	N/A
384-well TiO2 coated plates	X-BODY Biosciences	TiO-96-CM