Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 'Конец расщепление пре-мРНК подложках<em> В пробирке</em
Summary
РНК-полимераза синтезирует II РНК-предшественник, который выходит за пределы конца 3'зрелой мРНК. Конец зрелой РНК генерируется cotranscriptionally, на участке, диктуемого последовательностей РНК, с помощью эндонуклеазы активности расщепления комплекса. Здесь мы подробно метод для изучения реакции расщепления в пробирке.
Abstract
3'-конец мРНК млекопитающих не образуется резким терминации транскрипции РНК-полимеразой II (RNPII). Вместо этого, RNPII синтезирует предшественник мРНК после окончания зрелых РНК, а активный процесс эндонуклеазной активности требуется в определенном месте. Расщепление РНК-предшественника обычно происходит 10-30 нт ниже по течению от консенсуса сайте поли (AAUAAA) после ЦА динуклеотидов. Белки от расщепления комплекса, многофакторной белкового комплекса около 800 кДа, выполнить эту конкретную нуклеазную активность. Конкретные последовательности РНК выше по течению и ниже по течению от сайта поли контролировать набору расщепления комплекса. Сразу после расщепления, предварительно мРНК полиаденилированной по полимеразы поли (PAP) с получением зрелых стабильных РНК сообщения.
Обработка 3'-конца РНК-транскрипта могут быть изучены с помощью клеточных Ядерные экстракты со специфическими меченных РНК подложках. В общем, долго 32 </ SUP> P-меченого предшественника нерасщепленной РНК инкубируют с нуклеарных экстрактов в пробирке, и расщепление оценивается путем гель-электрофореза и авторадиографии. Когда происходит собственно расщепление, короче 5 'расщепляется продукт обнаружены и количественно. Здесь мы описываем расщепление анализа подробно с использованием, в качестве примера, 3'-конце обработку ВИЧ-1 мРНК.
Introduction
Биосинтез большинства зрелых эукариотических РНК сообщений (мРНК) требует нескольких пост-транскрипционные модификации, такие как покрывая, соединения и полиаденилирование. Эти модификации, как правило, в сочетании, чтобы обеспечить правильную обработку 1 и сильно увеличить стабильность мРНК.
3 'конец формирование млекопитающих пре-мРНК генерируется эндонуклеолитического расщепления возникающей РНК с последующим добавлением аденилат остатков на 5' расщепляется продукт поли (А)-полимеразы (PAP) 2-4. У млекопитающих расщепление осуществляется многокомпонентной белкового комплекса, примерно 800 кДа, который собирает на предварительно определенных последовательностей РНК. Поли (А) сигнальная последовательность, высоко консервативны канонический последовательность гексануклеотид AAUAAA, направляет сайт расщепления примерно 10-30 нуклеотидов ниже по течению. Этот сайт специально признана расщепления и полиаденилирования фактор специфичности (CPSF) и 73 кДа субъединицыCSPF содержит эндонуклеазной активности. Коэффициент стимуляции расщепления (CSTF) связывает больше вырождаются ГУ-или U-богатые последовательности элемент вниз по течению от поли (А) сайта. Также требуется для расщепления является млекопитающее фактор расщепление I (CFIm) и млекопитающих фактор расщепление II (CFII). CFIm связывает конкретные UGUA (N) сайтов в элементах вверх по течению последовательности (использует), которые были определены для ряда генов и, кажется, быть вовлечены в важных физиологических процессов 5-8.
В пробирке, реакции процессинга РНК, как правило, анализировали с использованием радиоактивно меченных РНК подложках 9-12. Они могут быть синтезированы стекания транскрипции с промотора бактериофага Т7 или SP6. При изучении сайт полиаденилирования, который не был охарактеризован ранее, необходимо использовать геномную ДНК, а не для генерирования кДНК РНК субстрат, в качестве важных ниже по течению последовательности не могут присутствовать в кДНК. Дизайн подложки включить по крайней мере, 150 нт upstreaм и 50 нт ниже по течению от расщепления сайта / конце на зрелой мРНК. Продукт расщепления мигрирует быстрее, чем подложка; однако, потому что другие фрагменты могут генерироваться неспецифической нуклеазной действия, специфичность реакции должна быть проверена на ее зависимость от правильных последовательностей сигналов обработки. Таким образом, РНК подложки с точечной мутации в последовательности AAUAAA (например AAGAAA) служить в качестве отрицательного контроля для реакции расщепления.
Учитывая, что небольшое количество радиоактивно помеченных РНК используется для реакции расщепления, РНКазы, присутствующие в высокой численности в большинстве ядерных экстрактов может быть проблематичным, и ограничивают выбор исходного материала для получения экстракта. HeLa клетки имеют тенденцию содержать низкие уровни эндогенных РНКазы, и, таким образом, хорошо работать в этих анализах.
Эндонуклеолитического расщепление РНК субстратов в виво и ин витро немедленно следует поли (A) добавление, чтс промежуточным расщепляют нет в обнаруживаемых количествах. Поэтому для изучения либо конкретную последовательность или белки, участвующие в реакции расщепления РНК, эксперименты выполнены в условиях, которые предотвращают возникновение полиаденилирования. Там нет зависимости расщепления на полиаденилирование, или наоборот, так что можно остановить полиаденилирование без ущерба для реакции расщепления. Таким образом, АТФ заменяется цепной прекращения аналога, который испытывает недостаток гидроксильную группу 3 'так, что только один нуклеотид могут быть включены в поли (А)-сайте и просто расщепляется РНК могут быть обнаружены.
Учитывая сложность и высокая степень особенностью данного типа анализа, мы описываем подробный протокол видео для изучения эндонуклеолитического расщепление по расщепления / поли (А) машин прекурсоров мРНК в пробирке. Мы опишем, как подготовить компетентных ядерные экстракты, генерировать радиоактивно помеченных РНК субстраты, проводить реакцию расщепления и анализировать и интерпретировать результатING продукты. 1 показан пример подложки РНК, кодирующих 3'-конца ВИЧ-1 пре-мРНК, которые будут использоваться для расщепления анализа. 3 'конец РНК генома ВИЧ состоит из множества важных регуляторных последовательностей, таких как поли (А)-сайте, богатой области G+ U, а также использование элемента, которые являются всем необходимым для эффективного созревания вирусных транскриптов мРНК 13 . В этом примере мы ожидаем, что вход РНК субстрат быть 338 нт и при расщеплении 237 нт. Если полиаденилирования разрешили произойти, мазок из продуктов будет наблюдаться между 237 и 437 нт.
Protocol
Representative Results
Discussion
Реакция расщепления в пробирке пре-мРНК 3 ', осуществляется в ядерных экстрактов HeLa клеток или с факторами расщепления фракционированных из этих экстрактов, позволило выявить факторы расщепления основных и их основных комплексов 16-21. Многие другие белки, ассоциированные с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
С.В. благодарен за финансовой поддержке со стороны NIH K22AI077353 и Landenberger Foundation. KR благодарит финансирование от NIH (5SC1GM083754).
Materials
| 1L Celstir Flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 Position Slow Speed Stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table Top Centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250ml Conicle Tubes | Corning | 430776 | |
| 50ml Conicle Tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultra-clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK Modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium Chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5M Sodium Chloride Solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5M Solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher | A702-500 | |
| cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7000 0.5ml-3ml |
| 15ml Dounce Tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 Kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA Cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium Acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% Absolute Ethanol 200 Proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid Phenol-Chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation Fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase Inhibitor | Promega | N261B | |
| Poly (Vinyl alcohol) PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine Phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable Sequencing Unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder Clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20cmx42cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1SET |
| 20cmx22cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1SET |
| 20cmx42cm Aluminum Cooling Plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1EA |
| 0.4mmx22cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1SET |
| 0.4mmx42cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1SET |
| 8-well Comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1EA |
| 16-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1EA |
| 32-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1EA |
| Gel Repel Coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel Loading Tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10uL |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5000V/500mA/400W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark Markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8×10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14×17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography Cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8×10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U. 3′-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3’end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3′ end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. . mRNA formation and function. , 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. . RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).
- Chabot, B. . RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3′ end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2′-Fluoro- and 2′-amino-2′-deoxynucleoside 5′-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3′ processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3′-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3′ end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3′ end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3′ cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
