ثلاثة الثقافة الأبعاد للخلايا الظهارية الثديية على الغشاء القاعدي المعاد هو طريقة مفيدة لتلخيص العمارة في الجسم الحي من الثدي حميدة، والتفريق بين النمط الظاهري الخبيثة من النمط الظاهري الثدي حميدة. الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تطبيقه على دراسة سرطان الغازية في الأنسجة الأخرى.
سرطان الثدي الغازية هي مجموعة من الأورام الظهارية الخبيثة التي تتميز غزو الأنسجة المجاورة والميل إلى تنتشر. تفاعل الإشارات بين الخلايا السرطانية والمكروية التي تمارس تأثيرا قويا على نمو سرطان الثدي والسلوك البيولوجية 1. ومع ذلك، يتم فقدان معظم هذه الإشارات من المصفوفة خارج الخلية أو سلوكه أهميتها عندما تزرع الخلايا في الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) كما أحادي الطبقة. في السنوات الأخيرة، برز ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافة على الغشاء القاعدي المعاد كوسيلة لاختيار لألخص هندسة الأنسجة من خلايا الثدي الحميدة والخبيثة. الخلايا المزروعة في 3D الإبقاء على الإشارات الهامة من المصفوفة خارج الخلية وتوفير نظام فيفو السابقين 2،3 ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من المذكرة، هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما نمت في 3D بالمقارنة مع 2D 4. الثقافة 3Dيمكن استخدامها بشكل فعال كوسيلة للتمييز الخبيث من النمط الظاهري النمط الظاهري الثدي حميدة والتي تدعم إشارات الخلوية والجزيئية المعنية 3. واحدة من الخصائص المميزة للخلايا الظهارية الحميدة هي أنها الاستقطاب بحيث السيتوبلازم قمي هو نحو التجويف وتقع السيتوبلازم القاعدية على الغشاء القاعدي. يتم فقدان هذه الأقطاب apico القاعدية سرطان الثدي في الغازية، التي تتميز الفوضى الخلوية وتشكيل anastomosing والمتفرعة الأنابيب التي تتسرب جزافا ستروما المحيطة بها. يمكن استنساخها هذه الاختلافات التشريحية المرضية بين الغدة الحميدة وسرطان الغازية في 3D 6،7. باستخدام قراءة عموميات المناسبة مثل تحديد الكميات من الهياكل عنيبية دورة واحدة، أو التفاضلية التعبير الواسمات الجزيئية التحقق من صحة لتكاثر الخلايا، والاستقطاب وموت الخلايا المبرمج في تركيبة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأخرى، الثقافة 3Dه يمكن أن توفر أداة مهمة لفهم أفضل للتغيرات الخلوية خلال التحول الخبيث وترسيم إشارات المسؤولة.
ثلاثة الثقافة الأبعاد (3D) في خلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد هو نظام نموذجا هاما لدراسة النمط الظاهري المعقدة والإشارات المرتبطة الثدي الطبيعية وسرطان الثدي 2،3. وحدة وظيفية من الثدي هو وحدة مفصص القناة محطة (TDLU) الذي يتكون من القناة الصغيرة التي فروع في عنيبات. وعنيبات هي هياكل درجة عالية من التنظيم، يتكون من طبقتين الخلايا، والخلايا الظهارية عضلية ظهارية، والتي يحيط بها الغشاء القاعدي 5. أهم السمات المميزة لعنيبات العادية هي الاستقطاب الخلوية، المرفق إلى الغشاء القاعدي الكامنة والاتصالات خلية خلية متخصصة. تعطل هذه المنظمة المعقدة في سرطان الغازية. ثقافات 2D تستخدم على نطاق واسع، حيث تزرع الخلايا كما الطبقات الوحيدة، لا تسمح لتشكيل عنيبات. وبالتالي، فإن الثقافة أحادي الطبقة يعاني من نقص في توفير نظام للقبض على العلاقة المعقدة بين الخلايا الظهاريةفي الثدي العادية والتحرر من القيود في سرطان الثدي. وقد تم تطوير الثقافات الظهارية monotypic الوظيفية للخلايا الثدي في العديد من المختبرات 2،3. ينطوي الثقافة 3D نمو خلايا الثدي على Matrigel، وهو مستخلص مشتق من solubilized Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما ومتاح تجاريا. الطبقات التحتية 3D أخرى مثل الكولاجين تستخدم أيضا أنا. خلايا الثدي يمكن تربيتها في 3D بواسطة 3D مقايسة جزءا لا يتجزأ، حيث يتم استزراع الخلايا جزءا لا يتجزأ من Matrigel 2. بدلا من ذلك، الخلايا يمكن تربيتها من قبل 3D على رأس الفحص، وتسمى أيضا فحص 3D تراكب، والتي هي فعالة من حيث التكلفة لأنها تتطلب أقل من حجم Matrigel، ويسهل مرور الوقت مراقبة تشكيل مستعمرة من قبل التصوير النقيض من المرحلة، ويعتبر مثاليا لتصوير الوضع الطبيعي 2 في -3. تم استخدام 3D على رأس فحص لتحديد العلاقة بين النمط الظاهري عنيبية والتعبير الجيني الشخصي 7.
يمكن فعاليه الثقافة 3Dاعل تستخدم للتمييز بين الخلايا الطبيعية وحميدة من سرطان الغازية. خلايا الثدي العادية وحميدة تشكيل هياكل النمو القبض الاستقطاب مع التجويف واضحة المعالم في المركز على Matrigel في حين خلايا سرطان الغازية تنمو بغزارة وبشكل عشوائي مع عدم وجود تطهير التجويف. E6/E7 خلدت الخلايا الظهارية الثديية البشرية وخط الخلية MCF10A، الذي هو خط خلية خلد عفويا معزولا عن المريض 36 سنة مع التغيرات فيبروكيستيك، وقد استخدمت بنجاح لاستعادة النمط الظاهري الثدي حميدة في 3D 3،8 وكانت بمثابة نظام نموذجي لدراسة وظيفة القامع أنكجنيك والورم من عدة جزيئات 8،9. هذه الخلايا حميدة يمكن هندستها للتلاعب الجيني (ق) من الفائدة من خلال إدخال الفيروسة البطيئة / الارتجاعي. إذا كان الجين (ق) من الفائدة هو القامع الورم، وضربة قاضية shRNA بوساطة يؤدي إلى تحول خبيث في حين إذا كانت الجينات في المصالح هو من overexpression الجين الورمي في خلايا حميدةيجب أن يظهر النمط الظاهري الخبيثة. في كلتا الحالتين الهياكل عنيبية شكلت في 3D يمكن التقاط التحول الخبيث.
الخلايا واحد مطلي حميدة في 3D تبدأ في التكاثر وتشكيل الهياكل جولة كروية. بعد يوم 5-8 هذا الركام كروية من الخلايا سوف تفرق في طبقة المحيطة الاستقطاب من الخلايا التي هي في اتصال مع Matrigel، وكتلة من الخلايا الداخلية أقل الاستقطاب، والتي تفتقر اتصال مع Matrigel. في 10-15 يوما المقبلة سوف تبدأ الخلايا الداخلية للموت عن طريق موت الخلايا المبرمج تشكيل التجويف واضحة. الخلايا الخبيثة ستنمو فقدان جزافا قطبية بهم. الخلايا الخبيثة للغاية عادة تشكيل هياكل المتفرعة. هذه الاختلافات في النمط الظاهري يمكن التقاطها بواسطة الوقت الفاصل بين مرحلة التصوير وعلى النقيض من قبل في الموقع المناعية مع الواسمات الجزيئية ذات الصلة. علامات الأكثر شيوعا هي ألفا 6 إنتغرين، وقطبية علامة القاعدية، في تركيبة مع انتشار علامة الفوسفات هيستون-3 وapoptotجيم علامة المشقوق كاسباس 3. وهذا الأخير مهم لتحديد ما إذا كان هناك تشكيل التجويف في وسط عنيبات، وهي سمة من خلايا الثدي العادية وحميدة. وتشمل الاستقطاب والاتصال خلية خلية علامات أخرى GM130، laminin، إدارة مخاطر المؤسسات، E-كادهيرين. بالتناوب على خطوط خلايا سرطان الثدي يمكن هندستها لمعالجة الجينات في المصالح. في هذه الحالة الارتداد إلى المزيد من النمو القبض على النمط الظاهري حميدة يمكن أن تستخدم تلا تمييزها عن النمط الظاهري السرطان.
ويمكن أيضا أن تستخدم الثقافة 3D بعناية لترسيم مسارات الإشارات المشاركة في التحول الخبيث 10-11. باستخدام المذكورة أعلاه الرافضة قراءة، مثبطات الدوائية، والأجسام المضادة ومنع أو البروتينات المؤتلف ويمكن استخدام يتم تحديد في الإشارات الجزيئية التي تؤدي إلى التحول الخبيث. مع الجهود المستمرة من مختلف المختبرات فمن الممكن لاستخراج الخلايا من 3D لعزل الحمض النووي الريبي، وكذلك إعداد لست] لimmunoblotting واللقاحاتnoprecipitation. يتم وصف هذه الاستراتيجيات في خطوة بخطوة وبطريقة مفصلة في البروتوكول.
وصفناها هنا ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد وفائدة هذا النظام للتمييز بين الخبيث مقابل حميدة النمط الظاهري الثدي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لثقافة أنواع مختلفة من الخلايا من أنسجة غدية وأخرى تم الإبلاغ عن أن تكون قد استخد…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 CA107469، R01 CA125577، وU01CA154224 لCG Kleer، جامعة مركز السرطان دعم ميشيغان.
Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |