Tredimensjonal kulturer: Et verktøy for å studere Normal acinar Arkitektur vs malign transformasjon av brystkreft celler

Summary

Tredimensjonal kultur av melke epitelceller på en rekonstituert basalmembran er en nyttig metode for å rekapitulere in vivo arkitektur av godartet bryst, og for å skille den ondartede fenotype fra godartet bryst fenotype. Viktigere, kan dette systemet bli anvendt for å studere invasive karsinomer i andre vev.

Abstract

Invasiv brystcarsinomer er en gruppe av ondartede epiteliale tumorer karakterisert ved invasjon av tilgrensende vev og tilbøyelighet til å metastasere. Samspillet av signaler mellom kreftceller og deres mikromiljøet utøver en sterk innflytelse på brystkreft vekst og biologisk atferd ^en. Imidlertid er de fleste av disse signaler fra den ekstracellulære matriks er tapt eller deres relevans er studert når cellene er dyrket i kultur todimensjonal (2D) som et monolag. I de senere årene har tredimensjonale (3D) kultur på en rekonstituert basalmembran dukket opp som en metode for valg å rekapitulere den vevsarkitektur av godartede og ondartede brystcellene. Celler dyrket i 3D beholde de viktige signaler fra den ekstracellulære matriks og gir en fysiologisk relevant ex vivo-system ^2,3. Av notatet, det er økende bevis som tyder på at cellene oppfører seg annerledes når de dyrkes i 3D i forhold til 2D ^fire. 3D kulturkan være effektivt brukes som et middel til å differensiere ondartet fenotype fra godartet bryst fenotype og for å underbygge den cellulære og molekylære signal involvert ^tre. En av de karakteristiske egenskapene til benigne epiteliale celler er at de er polarisert slik at den apikale cytoplasma ligger mot hulrommet og den basale cytoplasma hviler på basalmembranen. Dette apico-basal polaritet er tapt i invasive brystcarsinomer, som er preget av mobilnettet uorden og dannelse av anastomering og forgrening tubuli som måfå til det omliggende stroma. Disse histopatologiske forskjeller mellom godartet kjertel og invasive carcinoma kan reproduseres i 3D ^6,7. Ved hjelp av de aktuelle lese-outs som kvantifisering av enkelt runde acinar strukturer, eller forskjells uttrykk for validerte molekylære markører for celledelingen, polaritet og apoptose i kombinasjon med andre molekylære og cellebiologiske teknikker, 3D kulturelte kan gi et viktig verktøy for å bedre forstå de cellulære forandringer under malign transformasjon og for opptegning av ansvarlig signalering.

Introduction

Tredimensjonal kultur (3D) av bryst epitelceller på rekonstituert basalmembran er en viktig modellsystem for å studere den komplekse fenotype og tilhørende signalisering av normalt bryst-og brystkreft ^2,3. Den funksjonelle enhet av brystkreft er terminalkanalen lobul enhet (TDLU) som består av en liten kanal som grener inn acini. De acini er svært organiserte strukturer, bestående av to cellelag, epiteliale og korg celler, som er omgitt av en basalmembran ^fem. De mest karakteristiske trekk ved normale acini er mobilnettet polarisering, vedlegg til den underliggende basalmembran og spesialiserte celle-celle kontakter. Denne intrikate organisasjonen blir forstyrret i invasive karsinomer. De mest brukte 2D kulturer, der cellene er dyrket som monolayers, ikke tillater for dannelsen av acini. Således er monolag-dyrknings-mangler i å gi et system for å fange opp den intrikate forholdet mellom epitelcelleri normal bryst og deres deregulering i brystkreft. Funksjonelle monotypisk epitel kulturer av brystkreft celler har blitt utviklet i flere laboratorier ^2,3. 3D kultur omfatter vekst av bryst-celler på Matrigel, som er et solubilisert ekstrakt avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom-celler, og er tilgjengelig kommersielt. Andre 3D grunnen som kollagen Jeg er også brukt. De bryst celler kan dyrkes i 3D av 3D innebygd analysen, der cellene dyrkes innebygd i Matrigel ^to. Alternativt kan cellene dyrkes ved 3D oppå analyse, også kjent som 3D-overleggsanalyse, noe som er kostnadseffektivt og den krever mindre volum av Matrigel, og letter tidsforløp overvåking av kolonidannelse ved fasekontrast avbildning og er ideell for in situ avbildning ^{2 -3.} 3D på toppen analysen har blitt brukt til å definere sammenhengen mellom acinar fenotype og genuttrykk profil ^7.

3D kultur kan effektiviEly brukes til å skille normale og godartede celler fra invasive carcinoma. Normal og godartede brystcellene danner vekst arrestert polariserte strukturer med en veldefinert lumen i sentrum på Matrigel mens invasive carcinoma celler vokse frodig og måfå uten clearing av lumen. E6/E7 udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller og MCF10A cellelinje, som er et spontant udødeliggjort cellelinje isolert fra en 36 år gammel pasient med fibrocystic endringer, har blitt brukt til å gjenerobre den godartet bryst fenotype i 3D ^3,8 og har fungert som et modellsystem for å studere den onkogene og tumor suppressor funksjon av flere molekyler ^8,9. Disse godartet cellene kan bli konstruert for å manipulere gen (er) av interesse ved innføring av lentivirus / retrovirus. Hvis genet (er) av interesse er en tumor suppressor, vil shRNA-mediert knockdown føre til malign transformasjon mens hvis genet av interesse er et onkogen overekspresjon i godartede cellerbør vise en ondartet fenotype. I begge tilfeller acinar strukturer dannet i 3D kan fange malign transformasjon.

Godartede enkeltceller belagt i 3D begynner å spre seg og danne runde sfæriske strukturer. Etter dag 5-8 denne sfæriske aggregat av celler vil differensiere til et området polarisert lag av celler som er i kontakt med Matrigel, og en indre masse av mindre polariserte celler, som mangler kontakt med Matrigel. I de neste 10-15 dagene de indre cellene begynner å dø ved apoptose danner en klar lumen. De ondartede celler vil vokse måfå miste sin polaritet. Svært ondartede celler danner vanligvis forgrening strukturer. Disse forskjellene i fenotype kan bli fanget av tid forfalle fase kontrast bildebehandling og ved in situ farging med relevante molekylære markører. De mest brukte markører er alpha 6-integrin, en basal polaritet markør, i kombinasjon med spredning markør fosfo-histon-3 og apoptotic markør kløyvde caspase-3. Det siste er viktig for å bestemme om det finnes hulrom formasjonen i midten av acini, en funksjon av normale og godartet bryst-celler. Andre polaritet og celle-celle kontakt markører GM130, laminin, ERM, E-cadherin. Alternativt brystkreft cellelinjer kan være konstruert for å manipulere genet av interesse. I dette tilfelle tilbakevending til en mer vekst stanses benign fenotype kan brukes som en lest ut for å skille fra kreften fenotype.

3D kultur kan også være nøye brukes til å avgrense de signalveier involvert i malign transformasjon ^10-11. Ved hjelp av de ovenfor nevnte avlesinger, farmakologiske inhibitorer, blokkering antistoffer eller rekombinante proteiner kan bli brukt kan fastslå at den molekylære signalering som fører til malign transformasjon. Med fortsatt innsats fra ulike laboratorier er det mulig å hente ut cellene fra 3D å isolere RNA og også forberede lysates for immunoblotting og immungnoprecipitation. Slike strategier er beskrevet i en trinnvis og detaljert måte i protokollen.

Protocol

En. Utarbeidelse av materialer og Kultur Media Tine vekstfaktor redusert (GFR) Matrigel ved 4 ° CO / N. Varm opp komplette media for nødvendig cellelinje ved 37 ° C. MCF10A-ATCC spesifisert media; HME-Hams F-12 medium supplert med 5% føtalt bovint serum, 1 ug / ml hydrokortison, 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor, og 100 ng / ml koleratoksin; SUM149-Kams F-12 media supplert med 5% FBS, 2 mikrogram / ml hydrokortison og 5 mikrogram / ml insulin; og MDA-MB-231-10% FBS-DMEM <l…

Representative Results

3D kultur kan være effektivt brukes til å skille ondartet fenotype av menneskelige brystkreft epitelceller fra godartet bryst. Enkelt godartede celler belagt på Matrigel vokse som organiserte sfæriske strukturer som lett kan avbildes som enkelt runde flat acini i ett plan ved hjelp av fase kontrast bildebehandling. Enkelt ondartede celler sådd ut på Matrigel vokse måfå, viser meget høy brytningsindeks og er vanskelige å bilde i ett plan. Som vist i figur 1, godartet HME og MCF10A cellene danne…

Discussion

Vi har beskrevet den tredimensjonale kulturen av bryst epitel-celler i et rekonstituert basalmembran og nytten av dette systemet til å skille mellom ondartede vs benign bryst fenotype. Dette systemet kan også brukes til å kultur forskjellige celletyper fra andre glandulært vev, og er blitt rapportert å ha blitt brukt til kultur prostata epitelial, bronkiale epitelceller, og skjoldbrusk epitelceller, for å nevne noen ^{av 12-14.} Betydningen av 3D-kulturen ligger i det faktum at det er en fysiologisk releva…

Materials

Growth Factor Reduced matrigel	BD biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2- well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientifics	MAB1378	1:00 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:00 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientifics	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF