सेल दीवारों की लोचदार संपत्तियों की AFM आधारित मैपिंग: ऊतक, सेलुलर, और Subcellular प्रस्तावों पर
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
हम एक JPK AFM के लिए, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) माइक्रो / नैनो indentations का उपयोग संयंत्र के ऊतकों की सतहों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक हाल ही में विकसित विधि का वर्णन. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में हम फूलों मेरिस्टेमों, hypocotyls, और जड़ों में एक्स 100 माइक्रोन तक के लिए 100 माइक्रोन के क्षेत्रों में subcellular प्रस्तावों पर सेल दीवारों का स्पष्ट यंग मापांक उपाय. इस नमूने की सावधान तैयारी, सूक्ष्म Indenters और खरोज गहराई का सही चयन की आवश्यकता है. केवल, माप कोशिकाओं plasmolyze और इस तरह सेल टर्गर दबाव के योगदान को दूर करने के क्रम में mannitol की अत्यधिक ध्यान केंद्रित समाधान में प्रदर्शन कर रहे हैं सेल दीवार गुणों के लिए खाते.
अन्य मौजूदा तकनीक के विपरीत, अलग Indenters और खरोज गहराई का उपयोग करके, इस विधि, एक साथ multiscale माप की अनुमति देता है <em> Subcellular प्रस्तावों पर और एक ऊतक शामिल कोशिकाओं के सैकड़ों भर में अर्थात्. यह बात स्थानिक-अस्थायी विकास और भिन्नता के साथ सहसंबद्ध किया जा करने के लिए इन परिवर्तनों को सक्षम करने, विकास के दौरान सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों में उस जगह ले परिवर्तन को चिह्नित करना अब संभव है कि इसका मतलब है. इस समन्वित सूक्ष्म सेलुलर परिवर्तन macroscopic morphogenetic घटनाओं के बारे में लाने के लिए समझने की एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है.
हालांकि, कई सीमाएं रह: विधि केवल (100 व्यास में माइक्रोन के आसपास) और केवल बाहरी ऊतकों पर काफी छोटे नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है; विधि ऊतक स्थलाकृति के प्रति संवेदनशील है; यह ऊतक की जटिल यांत्रिक गुणों की ही कुछ पहलुओं के उपाय. तकनीक तेजी से विकसित किया जा रहा है और यह इन सीमाओं के सबसे निकट भविष्य में हल हो जाएगा संभावना है.
Introduction
पौधों में विकास जीव के हर कोशिका है कि चारों ओर कठोर सेल दीवारों के समन्वित विस्तार से हासिल की है. सबूत जमा यह पौधों स्थानीय स्तर पर इस विस्तार है कि नियंत्रण सेल दीवार रसायन शास्त्र के संशोधन के माध्यम से इंगित करता है. विस्तार सेल के उच्च टर्गर दबाव की वजह से सेल दीवारों, पर तनाव द्वारा मुख्य रूप से संचालित होने लगा है; टर्गर दबाव को इस तनाव प्रतिक्रिया सेल दीवारों 1 के यांत्रिक गुणों से नियंत्रित होता है. लिटिल इन यांत्रिक गुणों के लिए जाना जाता है और वे विकास के दौरान बदल कैसे. इसके अलावा छोटे इन यांत्रिक गुणों प्रतिपुष्टि जाहिरा तौर पर एक ऊतक भर में समन्वित है कि एक तरह से कोशिका दीवार रसायन शास्त्र में परिवर्तन करने के लिए योगदान है कि क्या नियंत्रित कर रहे हैं और कैसे के नाम से जाना जाता है. हम रासायनिक और यांत्रिक विकास के दौरान संयंत्र सेल दीवारों में परिवर्तन, और अंततः कैसे इन सूक्ष्म बातचीत एक संयंत्र को नियंत्रित के बीच संबंध को समझने के लिए कर रहे हैंके macroscopic विकास, सेलुलर या ऊतक पैमाने पर अंगों के विकास में सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों की निगरानी कर सकते हैं कि एक विधि की आवश्यकता है.
परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) विधि माइक्रोमीटर या नैनोमीटर ऊतक compressions या indentations पर आधारित है, जो यहाँ वर्णित, subcellular प्रस्तावों पर एक साथ अंगों के विकास में और ऊतकों की संपूर्ण क्षेत्रों में सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए ठीक से विकसित किया गया था. अन्य तरीके हैं या तो बहुत कम या बहुत अधिक है कि एक संकल्प: एक्सटेन्सोमीटर मिलीमीटर पैमाने 2-4, में प्रारंभिक घटनाओं को मापने के लिए बहुत बड़ा उदाहरण के लिए है कि एक पैमाने पर एक पूरे ऊतक की औसत यांत्रिक गुणों को मापने के लिए केवल सक्षम है जीवोत्पत्ति; microindenter नैनोमीटर पैमाने पर subcellular संकल्प पर माप ले जा सकते हैं, लेकिन यह अलग कक्षों और नहीं कोशिकाओं और अंगों 5-7 के समूहों को मापने के लिए प्रतिबंधित है. AFM के साथ, की आवश्यकताडी ऊतक, सेलुलर, और subcellular प्रस्तावों 8-10 प्राप्त किया जा सकता है. हाल ही में कई प्रोटोकॉल भी 11, 12 इस्तेमाल किया जा सकता है कि पौधों के ऊतकों की यांत्रिकी को मापने के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया है.
हम स्पष्ट यंग मापांक 13 की माप के माध्यम से ऊतक की लोच का मूल्यांकन करने के लिए कैसे यहाँ पेश करेंगे.
यंग मापांक सामान्यतः एक सामग्री की कठोरता का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. छोटे विरूपण के दौरान एक सामग्री ख़राब करने के लिए आवश्यक बल खरोज के क्षेत्र के लिए आनुपातिक है. यंग मापांक इस गुणांक है. एक निरंतर समरूप सामग्री के मामले में एक ही गुणांक की परवाह किए बिना खरोज प्रकार (आकार और आकार) के मापा जाएगा लेकिन माप की गति के साथ बदल जाएगा. पौधों के ऊतकों की जटिल संरचना के मामले में, हम अब तक शक्ति दृढ़ संकल्प की अनुमति देने के विरूपण के लिए आनुपातिक है कि मनायाहम "स्पष्ट युवा मापांक" नाम देते हैं समानता का एक गुणांक. पौधों में निरंतर medias से विपरीत, यह स्पष्ट युवा मापांक खरोज के आकार के प्रति संवेदनशील है. यह एक शुद्ध सेल की दीवार के युवा moduli के अनुरूप नहीं है. यह सबसे अच्छा ऊतकों की कोशिका दीवार के मचान की लोच का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
पौधों में, बदलते यांत्रिक गुणों के विकास और morphogenesis निर्देशन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. तिथि करने के लिए वहाँ पौधों की वृद्धि को नियंत्रित कि आनुवंशिक और रासायनिक नेटवर्क unraveling में काफी प्रगति कर दि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए यवेस Couder को विशेष धन्यवाद देना. हम cantilevers और चर्चा की जांच के लिए अतेफ Asnacios धन्यवाद. हम महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए लिसा विलिस, इलियट Meyerowitz, और ओलिवर Hamant धन्यवाद. इस काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान RGP0062/2005-C हिस्से में वित्त पोषित किया गया था; एजेंस Nationale डे ला Recherche'''' Growpec,'' और'' Mechastem परियोजनाओं.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
Riferimenti
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
