رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
نحن تصف طريقة تم تطويرها مؤخرا لقياس الخواص الميكانيكية للأسطح الأنسجة النباتية باستخدام القوة الذرية المجهري (AFM) الصغيرة / نانو المسافات البادئة، لJPK فؤاد. على وجه التحديد، في هذا البروتوكول نقيس معامل يونغ واضحة من جدران الخلايا في قرارات التحت خلوية عبر المناطق تصل إلى 100 × 100 ميكرومتر ميكرومتر في الخلايا الإنشائية الأزهار، hypocotyls، والجذور. هذا يتطلب إعدادا دقيقا من العينة، واختيار الصحيح من indenters الصغيرة وأعماق المسافة البادئة. لحساب خصائص جدار الخلية فقط، يتم تنفيذ القياسات في حلول مركزة للغاية من مانيتول ليحل الجبلة الخلايا، وبالتالي إزالة مساهمة ضغط تورم الخلية.
وعلى النقيض من تقنيات موجودة الأخرى، وذلك باستخدام indenters مختلفة وأعماق المسافة البادئة، وهذه الطريقة تسمح قياسات متعددة النطاقات في وقت واحد، <em> أي في قرارات التحت خلوية وعبر مئات من الخلايا تتكون من الأنسجة. وهذا يعني أن من الممكن الآن لتوصيف مكانيا زمانيا التغييرات التي تحدث في الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا أثناء التطور، وتمكين هذه التغييرات تكون مرتبطة مع النمو والتمايز. هذا يمثل خطوة أساسية لفهم كيفية تحقيق التغيرات الخلوية المجهرية منسقة حول الأحداث التخلق العيانية.
ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود: لا يمكن إلا أن طريقة استخدامها على عينات صغيرة نسبيا (حوالي 100 ميكرون في القطر) وفقط على الأنسجة الخارجية؛ طريقة حساسة للتضاريس الأنسجة؛ فهو يقيس جوانب معينة فقط من الخواص الميكانيكية المعقدة الأنسجة و. ويجري تطوير هذه التقنية بسرعة وأنه من المرجح أن معظم هذه القيود سيتم حلها في المستقبل القريب.
Introduction
ويتحقق النمو في النباتات عن طريق التوسع المنسق لجدران الخلايا الجامدة التي تحيط كل خلية من خلايا الكائن الحي. تراكم الأدلة تشير إلى أنه من خلال تعديل الكيمياء جدار الخلية أن النباتات السيطرة محليا هذا التوسع. ويعتقد أن توسع لتكون مدفوعة أساسا عن طريق الضغط على جدران الخلايا، والناجمة عن ارتفاع ضغط تورم الخلية؛ ويخضع هذا الرد سلالة لضغوط تورم من قبل الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا 1. لا يعرف الا القليل من هذه الخصائص الميكانيكية وكيف تتغير خلال التنمية. وعلاوة على ذلك والقليل المعروف عن كيفية التحكم في هذه الخصائص الميكانيكية وعما إذا كانت الاصداء يسهم في تغيير كيمياء جدار الخلية بطريقة ما يبدو أن يتم تنسيق عبر الأنسجة. إذا أردنا أن نفهم العلاقة بين التغيرات الكيميائية والميكانيكية في جدران الخلايا النباتية خلال التنمية، وفي نهاية المطاف كيف تحكم هذه التفاعلات المجهرية مصنعمطلوب النمو 'ق العيانية، وهو الأسلوب الذي يمكن رصد الخصائص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير الأجهزة على المستوى الخلوي أو الأنسجة.
أسلوب القوة الذرية المجهري (فؤاد) وصفها هنا، والتي تقوم على ميكرومتر أو نانومتر الضغط على الأنسجة أو المسافات البادئة، وقد وضعت على وجه التحديد لقياس الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير أجهزة في وقت واحد في قرارات التحت خلوية وعبر مناطق بأكملها من الأنسجة. أساليب أخرى إما قرارا منخفضة جدا أو مرتفعة جدا: على التمدد هو فقط قادرة على قياس متوسط الخواص الميكانيكية للأنسجة كلها في نطاق ملليمتر 2-4، وهو النطاق الذي هو على سبيل المثال كبيرة جدا لقياس الأحداث في وقت مبكر من توالد؛ وmicroindenter يمكن أخذ القياسات في قرار التحت خلوية على مقياس متناهي الصغر، لكنه يقتصر على قياس خلايا معزولة وليس مجموعات من الخلايا أو الأجهزة 5-7. مع فؤاد، وتتطلبد الأنسجة الخلوية، وقرارات التحت خلوية ويمكن تحقيق 8-10. في الآونة الأخيرة تم تطوير العديد من البروتوكولات خصيصا لقياس اليات الأنسجة النباتات التي يمكن أن تستخدم أيضا 11 و 12.
سنستعرض هنا كيفية تقييم مرونة الأنسجة من خلال قياس معامل الظاهر يونغ 13.
يتم استخدام معامل يونغ عادة لوصف صلابة من المواد. خلال تشويه صغيرة القوة المطلوبة لتشوه مادة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. معامل يونج هو هذا معامل. في حالة وجود مواد متجانسة المستمر سيتم قياس معامل نفسه بغض النظر عن نوع المسافة البادئة (الحجم والشكل) ولكن سوف يتغير مع سرعة القياس. في حالة من بنية معقدة من أنسجة النباتات، وقد لاحظنا حتى الآن أن القوة تتناسب مع تشوه السماح تحديدمعامل التناسب أننا اسم "معامل الشباب على ما يبدو". في المقابل من وسائط الإعلام المستمر في النباتات، وهذا واضح معامل الشباب حساس لحجم المسافة البادئة. أنها لا تتوافق مع معاملات الرجوعية الشباب من جدار الخلية نقية. فهو يصف أفضل مرونة من السقالات من خلايا جدار الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في النباتات، وتغيير الخواص الميكانيكية تلعب دورا رئيسيا في توجيه النمو والتشكل. حتى الآن لم يكن هناك تقدم كبير في كشف شبكات الوراثية والكيميائية التي تتحكم في نمو النبات، ولكن معرفتنا لكيفية مساهمة هذه الشبكات إلى وتتأثر التغيرات في الخواص الميكانيكية بدائية. يجب أ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدم شكر خاص لإيف Couder لكثير من المناقشات المفيدة. نشكر عاطف Asnacios لمعايرة الكابولي والمناقشة. نشكر ليزا ويليس، إليوت Meyerowitz، وأوليفر Hamant لقراءة نقدية. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من منحة RGP0062/2005-C برنامج العلوم الحدودي الإنسان؛ الوكالة الوطنية للبحوث دي لا تتوقع'' Growpec،'''' وMechastem''.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
Riferimenti
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
