細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
我々は、JPK AFMのために、原子間力顕微鏡（AFM）マイクロ/ナノくぼみを用いて植物組織の表面の機械的特性を測定するために、最近開発された方法を記載している。具体的には、このプロトコルでは、我々は花の分裂組織、胚軸および根×100ミクロンまで100μmの地域間で細胞内の解像度で細胞壁の見かけのヤング率を測定します。これは、サンプルの慎重な準備、マイクロ圧子とインデントの深さを正確に選択する必要があります。唯一の細胞壁の特性を考慮して、測定は、細胞を原形質分離を起こさせる、従って、細胞膨圧の寄与を除去するために、マンニトールの高濃度溶液中で行われる。
他の現存の技術とは対照的に、別の圧子の押し込み深さとを用いて、この方法は、マルチスケール同時測定を可能にする<em>細胞下解像度で組織を含む細胞の数百横切って、すなわち。これは、空間的時間的に増殖および分化と相関することが、これらの変更を可能にする、開発中に、細胞壁の機械的特性で起こる変化を特徴付けることが可能であることを意味する。これは協調顕微鏡的細胞変化が巨視的形態形成のイベントをもたらすかを理解するために重要なステップを表します。
しかし、いくつかの制限が残っているこの方法はかなり小さな試料（直径100ミクロン程度）にして、外部の組織にのみ使用することができます。方法は、組織地形の影響を受けやすいです。それは、組織の複雑な機械的特性のみ特定の側面を測定します。技術が急速に開発されており、これらの制限のほとんどは、近い将来に解決される可能性がある。
Introduction
植物における成長は、各々を取り囲む硬質細胞壁の協調膨張および生物のあらゆる細胞によって達成される。証拠が蓄積することは、植物が局所的にこの膨張を制御すること、細胞壁の化学的性質の改変によるものであることを示している。膨張は、細胞の高い膨圧によって引き起こされる、セル壁に株によって主に駆動されると考えられている;膨圧この歪み応答は、細胞壁1の機械的特性によって支配される。少しは、これらの機械的特性が知られており、それらは開発中にどのように変化するか。さらには、これらの小さな機械的特性を制御する方法で明らかにし、この組織を横切って調整されるようにして細胞壁の化学的性質を変化させるために貢献するかどうかは知られている。我々は、開発中に、植物細胞壁中の化学的および機械的変化との間の接続を理解することであり、これらの微視的な相互作用は、プラントを管理する場合には、最終的にどのようにの巨視的成長、細胞または組織スケールでの臓器の開発における細胞壁の機械的特性を監視することができる方法が必要とされる。
原子間力顕微鏡（AFM）マイクロメートルまたはナノメートルの組織の圧迫又はくぼみに基づいてここで説明する方法は、正確に細胞下解像度で同時に臓器の開発に組織の全領域にわたって細胞壁の機械的特性を測定するために開発された。伸びは、ミリメートルスケール2-4における全組織の平均的な機械的特性を測定することができるだけであり、例えばにおける初期事象を測定するには大きすぎる規模：他の方法が低すぎたり高すぎる解像度のいずれかを有する器官形成; microindenterは、ナノメートルスケールでの細胞内の分解能で測定を行うことができますが、単離した細胞ではない細胞または器官5-7のグループの測定に限定されている。 AFMで、必要とするdは、組織、細胞、および細胞下解像度は8-10達成することができる。最近、いくつかのプロトコルはまた、11、12を用いることができる植物組織の力学を測定するために特別に開発されてきた。
私たちは、見かけのヤング率13の測定により組織の弾力性を評価する方法をここに紹介します。
ヤング率は、一般に材料の剛性を説明するために使用される。微小変形中に材料を変形させるのに必要な力は、くぼみの面積に比例する。ヤング率は、この係数である。連続均質な材料の場合には同一の係数に関係なくインデントの種類（サイズと形状）の測定されますが、測定の速度で変化します。植物組織の複雑な構造の場合、我々はこれまで力判定を可能にする変形に比例することを観察した我々は「見かけヤング "という名前を比例係数。植物中の連続メディアからこれとは対照的に、この見かけヤング率は、インデントの大きさに敏感である。それは、純粋な細胞壁の若いモジュラスに対応していない。それは最高の組織の細胞壁の足場の弾力性を説明しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物では、変化する機械的特性は、成長や形態形成を演出に大きな役割を果たしている。これまでに存在し、植物の成長を制御する遺伝的および化学的なネットワークの解明に大きな進歩であったが、これらのネットワークはに貢献し、機械的性質の変化によってどのような影響を受けるかについての我々の知識は、初歩的でもあります。このメソッドは、このギャップを埋めるために私た?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、多くの有用な議論のためにイヴCouderに特別な感謝を与える。私たちは、カンチレバーと議論のキャリブレーションのためのアテフAsnaciosに感謝します。我々は重要な読書のためにリサ·ウィリス、エリオットマイヤーウィッツ、そしてオリバーHamantに感謝します。この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムグラントRGP0062/2005-Cによって部分的に資金を供給された。通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュは'''' Growpec、''と'' Mechastemを投影する。
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
Riferimenti
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
