Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
Se describe un método recientemente desarrollado para medir las propiedades mecánicas de las superficies de los tejidos vegetales utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM) micro / nano-indentaciones, para un JPK AFM. En concreto, en este protocolo se mide el módulo aparente de Young de las paredes celulares en resoluciones subcelulares entre regiones de hasta 100 m x 100 m en los meristemos florales, hipocotilos y raices. Esto requiere una cuidadosa preparación de la muestra, la correcta selección de los micro-penetradores y profundidades sangría. Para tener en cuenta las propiedades de la pared celular sólo, las mediciones se realizan en soluciones altamente concentradas de manitol con el fin de plasmolizar las células y por lo tanto eliminar la contribución de la presión de turgencia de la célula.
En contraste con otras técnicas existentes, mediante el uso de diferentes penetradores y profundidades de indentación, este método permite mediciones multiescala simultánea, <em> Es decir, en las resoluciones subcelulares ya través de cientos de células que comprende un tejido. Esto significa que ahora es posible caracterizar espacialmente-temporalmente los cambios que tienen lugar en las propiedades mecánicas de las paredes celulares durante el desarrollo, lo que permite que estos cambios sean correlacionados con el crecimiento y la diferenciación. Esto representa un paso clave para entender cómo los cambios celulares microscópicas coordinadas provocar eventos morfogenéticos macroscópicas.
Sin embargo, varias limitaciones siguen siendo: el método sólo se puede utilizar en bastante pequeñas muestras (alrededor de 100 m de diámetro) y sólo en los tejidos externos; el método es sensible a la topografía de tejido; mide sólo algunos aspectos de las propiedades mecánicas complejas del tejido. La técnica se está desarrollando rápidamente y es probable que la mayoría de estas limitaciones se resolverán en un futuro próximo.
Introduction
El crecimiento de las plantas se logra por la expansión coordinada de las paredes celulares rígidas que rodean a cada célula del organismo. La acumulación de pruebas indica que es a través de la modificación de la química de la pared celular que las plantas locales controlan esta expansión. La expansión se piensa que es impulsado principalmente por la tensión en las paredes de las células, causados por la alta presión de turgencia de la célula; Esta respuesta cepa a la presión de turgencia se rige por las propiedades mecánicas de las paredes celulares 1. Poco se sabe de estas propiedades mecánicas y la forma en que cambia durante el desarrollo. Además, se sabe poco de cómo se controlan estas propiedades mecánicas y si evaluaciones contribuyen a alterar la química de la pared celular de una manera que está aparentemente coordinados a través de un tejido. Si vamos a entender la conexión entre los cambios químicos y mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo, y en última instancia, cómo estas interacciones microscópicas gobiernan una plantaSe requiere 's crecimiento macroscópico, un método que puede controlar las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos en la escala celular o tisular.
El método de microscopía de fuerza atómica (AFM) descrito aquí, que se basa en micrómetros o nanómetros compresiones de tejido o indentaciones, fue desarrollado precisamente para medir las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos simultáneamente en resoluciones subcelulares y a través de regiones enteras de tejido. Otros métodos tienen ya sea una resolución que es demasiado bajo o demasiado alto: el extensómetro sólo es capaz de medir las propiedades mecánicas medias de un tejido completo en la escala milimétrica 2-4, una escala que sea, por ejemplo, demasiado grande para medir los primeros eventos en organogénesis; la microindenter puede efectuar mediciones en resolución subcelular en la escala nanométrica, pero se limita a la medición de las células aisladas y no grupos de células u órganos 5-7. Con la AFM, la requierend tejido, celular, y las resoluciones subcelulares se pueden alcanzar 8-10. Recientemente, varios protocolos han sido desarrollados específicamente para medir la mecánica de los tejidos de plantas que también se podrían utilizar 11, 12.
Vamos a presentar aquí la forma de evaluar la elasticidad del tejido a través de la medición del módulo de Young de la aparente 13.
El módulo de Young se usa comúnmente para describir la rigidez de un material. Durante pequeña deformación la fuerza requerida para deformar un material es proporcional al área de indentación. El módulo de Young es este coeficiente. En el caso de un material homogéneo continua el mismo coeficiente se mide independientemente del tipo de indentación (tamaño y forma), pero va a cambiar con la velocidad de la medición. En el caso de la compleja estructura del tejido de las plantas, hemos observado hasta el momento que la fuerza es proporcional a la deformación que permite la determinación deun coeficiente de proporcionalidad que denominamos "módulo de elasticidad aparente". En contraste a partir de medios continuos en las plantas, este módulo de Young aparente es sensible al tamaño de la indentación. No corresponde a la joven módulos de una pared celular pura. Es mejor describe la elasticidad del andamiaje de la pared celular del tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las plantas, el cambio de propiedades mecánicas juegan un papel importante en dirigir el crecimiento y la morfogénesis. Hasta la fecha no ha habido un gran progreso en el descubrimiento de las redes genéticas y químicas que controlan el crecimiento de las plantas, pero nuestro conocimiento de cómo estas redes contribuyen y se ven afectados por los cambios en las propiedades mecánicas es rudimentaria. Este método nos debería permitir a llenar este vacío, y por lo que debe ser de gran interés para los cientí…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos un agradecimiento especial a Yves Couder útil para muchos debates. Agradecemos a Atef Asnacios para la calibración de los voladizos y discusión. Damos las gracias a Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, y Oliver Hamant para la lectura crítica. Este trabajo fue financiado en parte por la Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C subvención; la Agence Nationale de la Recherche proyecta'' Growpec'' y'' Mechastem''.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
Riferimenti
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
