नवजात pial सतह Electroporation
Summary
pial सतह बढ़ती ध्यान दिया जा रहा है कि सीएनएस में एक अद्वितीय पूर्वज क्षेत्र है. इस के साथ साथ, विस्तार एक संशोधित electroporation पद्धति का उपयोग करके इस पूर्वज क्षेत्र का तेजी से आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक विधि हम. यह प्रक्रिया सेल प्रजातियों और सेल भेदभाव में शामिल संकेत दे रास्ते के सेलुलर और आणविक जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बेटी की कोशिकाओं के भाग्य और गुणों को स्पष्ट करने के लिए.
Abstract
पिछले कई वर्षों से pial सतह की चोट के बाद सहित, भ्रूण प्रसवकालीन और वयस्क न्यूरो और gliogenesis दौरान महत्व की एक कीटाणु जगह के रूप में पहचान की गई है. हालांकि, आनुवंशिक रूप से इन पूर्वज आबादी से पूछताछ और उनके वंश पर नज़र रखने के लिए तरीके विशिष्टता या समय वायरस का उत्पादन खपत की कमी के कारण सीमित कर दिया गया था. इस प्रकार, इस क्षेत्र में प्रगति इस स्थान की जांच की केवल एक मुट्ठी के साथ अपेक्षाकृत धीमी रही है. Electroporation भ्रूण में तंत्रिका स्टेम सेल गुणों का अध्ययन करने के लिए एक दशक से अधिक के लिए इस्तेमाल किया, और अधिक हाल ही में प्रसव के बाद मस्तिष्क में किया गया है. यहाँ हम एक अनुकूलित electroporation के दृष्टिकोण पर आधारित pial सतह progenitors के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक कुशल, तेजी से, और सरल तकनीक का वर्णन. Pial सतह electroporation इस प्रकार इन कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक समय की बचत और आर्थिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व, इन progenitors के सतही आनुवंशिक लेबलिंग और हेरफेर के लिए अनुमति देता है.
Introduction
तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं स्तनधारी सीएनएस 1, 2 भर में मौजूद हैं. उनके स्वभाव और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के निलय क्षेत्रों के आसपास के भ्रूण और वयस्क कीटाणु क्षेत्रों में गुण बड़े पैमाने पर पिछले एक दशक से 1-3 में दर्ज किया गया है. बड़े भाग में, इस वजह से इस तरह के floxed alleles या 4 अनुरेखण रेट्रोवायरल वंश के तंत्रिका तंत्र विशिष्ट Cre पुनर्संयोजन के रूप में तेजी से सटीक आनुवंशिक उपकरण, के विकास के लिए किया गया है. हालांकि, एक पूर्वज क्षेत्र pial सतह पूर्वज ही हाल ही में किसी भी विस्तार से 5-7 में वर्णित किया गया क्षेत्र है और इंतजार कर रहा है व्यापक परीक्षा.
मस्तिष्क की pial सतह मस्तिष्क की सतह और आसपास के तानिका 8 के बीच इंटरफेस के रूप में परिभाषित किया गया है. बाद में विकास, neuroepithelial और, के दौरान, रेडियल glial अंत पैरों इस सतह 9,10 के लिए देते हैं. एफआईआर के कुछमानव मस्तिष्क और कई neuronal mitoses में सेंट न्यूरॉन्स इस क्षेत्र में 11 में मनाया जाता है. बाद में, भ्रूण neurogenesis के दौरान, cortical interneurons मध्यवर्ती क्षेत्र और subventricular क्षेत्र 12-14 में उनके प्रवासी मार्गों के अलावा, pial क्षेत्र पार करने के लिए जाना जाता है. इस अवधि के दौरान स्टेम कोशिकाओं को इस क्षेत्र से संवर्धित किया जा सकता है और यह न्यूरो और gliogenesis 5 के एक सक्रिय साइट प्रतीत होता है. वयस्क दिमाग में, यह interneurons hypoxic चुनौती 7 निम्नलिखित pial सतह progenitors से पैदा हो सकता है कि सूचना मिली है. हालांकि, भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के दौरान Genensis करने के लिए अपने को इस क्षेत्र के योगदान की वजह से विशेष रूप से इस क्षेत्र में 6 की जांच की कठिनाई की वजह से भाग में अस्पष्ट बनी हुई है. बेहतर colliculus में और प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में, सतही (या प्रांतस्था में परत मैं) interneurons अंतर्निहित उत्तेजक न्यूरॉन आबादी के सर्किट उत्पादन मिलाना और इस तरह signific योगदान कर सकते हैंइन संरचनाओं के कार्य करने के लिए antly. विशेष रूप से, परत 1 interneurons cortical कॉलम 15,16 के सतही और गहरी परतों को उनके व्यापक कनेक्टिविटी दी सेरेब्रल कॉर्टेक्स की ऊपरी परत भर में न्यूरॉन्स की फायरिंग को विनियमित करने के लिए प्रधानमंत्री की स्थिति में हैं. इसी तरह, क्षैतिज interneurons एक अपेक्षाकृत व्यापक क्षेत्र पर cortical और रेटिना फाइबर, परियोजना से उत्तेजक इनपुट प्राप्त करते हैं और दूरदराज के दृश्य उत्तेजनाओं 17,18 का जवाब देने neuronal आबादी के निषेध के लिए मध्यस्थता करने के लिए अनुमान लगाया जाता है. इसके अलावा, उनकी आकृति विज्ञान विकासशील दृश्य प्रणाली 19 में नमूनों तरंग गतिविधि में एक संभावित भूमिका निभाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. दिलचस्प है, interneuron विकास और परिपक्वता postnatally एक बड़ी हद तक होता है. इसके अलावा, यह परिपक्वता की प्रक्रिया neuronal गतिविधि द्वारा विनियमित किया जाना पाया गया है और इसलिए सर्किट समारोह 20,21 पर आजीवन परिणामों के साथ विकास plasticity की एक सब्सट्रेट है. विशेष रूप से, nओ प्रमोटरों विशेष रूप से transgenically इन कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं जो वर्णित हैं. डिवाइडिंग progenitors रेट्रोवायरस 7 के साथ लक्षित किया जा सकता लेकिन वायरस उत्पादन समय लगता है और सेल पारगमन के लिए आवश्यक उच्च titers उपज के लिए कौशल की आवश्यकता है.
यह तंत्रिका progenitors 4, 22, 23 में संकेत दे रास्ते के तेजी से और कुशल आनुवंशिक पूछताछ के लिए अनुमति देता है के रूप में electroporation सक्षम के चिकित्सकों के अध्ययन में एक पुनर्जागरण के लिए प्रेरित किया है. Electroporation unidirectionally निलय 4, 22, 23 के आसपास के proliferating progenitors में डीएनए ड्राइव करने के लिए सिर के बाहर करने के लिए बिजली के दालों के वितरण के द्वारा पीछा प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन,, शामिल है. Electroporation प्लाज्मिड transgenes 24 की अभिव्यक्ति के लिए सेल चक्र के एम चरण के माध्यम से कोशिकाओं के पारगमन की आवश्यकता प्रतीत होता है. विशेष रूप से, यह पाया गया है कि केवलplasmids के electroporation की 8 घंटे के भीतर एम दौर से गुजर कोशिकाओं निलय दीवार 24 ~ 160 मीटर के भीतर सभी कोशिकाओं को उनके प्रभावी वितरण के बावजूद transgenes व्यक्त करेंगे. यह परमाणु permeabilization रसायनों के कारण पद mitotic कोशिकाओं 25 में plasmids की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं, क्योंकि यह episomal plasmids के परमाणु पहुँच के लिए अनुमति देने में परमाणु लिफाफा टूटने के लिए की जरूरत की वजह से है कि अनुमान लगाया है. मूल रूप से भ्रूण 22 में कार्यरत, electroporation बहुत बाद में 26, 27 प्रसव के बाद मस्तिष्क में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया था. हाल ही में, हम pial सतह progenitors 6 की आनुवंशिक हेरफेर में उपयोग के लिए electroporation ढाल लिया है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग हम progenitors के दो अलग प्रजातियों इस क्षेत्र interneuronal और astrocytic 6 में जाहिरा तौर पर कर रहे हैं कि पता चला है. इस प्रोटोकॉल पूछताछ के लिए इन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक सरल, तेजी से, और शक्तिशाली तरीका विवरणइन कोशिकाओं के तंत्र विनियमन विकास की.
Protocol
Representative Results
Discussion
pial सतह progenitors के सफल electroporation के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलू हैं: 1) pial सतह को प्लाज्मिड मिश्रण का लक्ष्य; 2) इंजेक्शन स्थल पर रक्तगुल्म की पीढ़ी से परहेज; और 3) मध्यमस्तिष्क electroporation के साथ जुड़े मृत्यु से बचने.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों देवदारों सीनै के पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान, और गुएरिन परिवार से शमूएल Oschin व्यापक कैंसर संस्थान कैंसर रिसर्च फोरम पुरस्कार से समर्थन के साथ ही धन स्वीकार करना चाहते हैं. वर्णित परियोजना अनुसंधान संसाधन, ग्रांट UL1RR033176 के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा वित्त पोषित एक CTSI कोर वाउचर के रूप में समर्थन किया है, और translational विज्ञान, ग्रांट UL1TR000124 आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र पर अब हो गया है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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