Summary
A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.
Abstract
Ao longo dos últimos anos, a superfície pial tem sido identificada como um nicho germinal da importância durante embrionário, perinatal e adulto neuro e gliogenesis, incluindo após lesão. No entanto, os métodos para interrogar geneticamente essas populações progenitoras e acompanhamento de suas linhagens foi limitada devido à falta de especificidade ou demorado produção de vírus. Assim, o progresso nesta região tem sido relativamente lento, com apenas um punhado de investigações sobre este local. Eletroporação tem sido usado por mais de uma década a estudar as propriedades de células-tronco neurais no embrião, e mais recentemente no cérebro pós-natal. Aqui nós descrevemos uma técnica eficiente, rápida e simples para a manipulação genética de células progenitoras de superfície pial com base em uma abordagem eletroporação adaptado. Pial eletroporação superfície permite a rotulagem genética fácil e manipulação desses progenitores, representando, assim, uma abordagem de economia de tempo e econômica para estudar essas células.
Introduction
Células-tronco e progenitoras neurais estão presentes em todo o SNC de mamíferos 1, 2. A sua natureza e propriedades em zonas germinais embrionários e adultos que circundam as regiões do ventrículo do cérebro e da medula espinal tem sido extensivamente documentada na última década 1-3. Em grande parte, isso se deve ao desenvolvimento de ferramentas genéticas cada vez mais precisos, como o sistema nervoso recombinação Cre específica de alelos floxed ou retroviral linhagem rastreamento 4. No entanto, uma região-o progenitor exame abrangente pial progenitor superfície zona tem só recentemente foi descrito em detalhes 5-7 e aguarda.
A superfície pial do cérebro é definida como a interface entre a superfície do cérebro e meninges circundantes 8. Durante o desenvolvimento, neuroepithelial e, posteriormente, radiais metros finais da glia anexar a esta superfície 9,10. Alguns dos abetost neurónios no cérebro humano e de muitos mitoses neuronais são observadas nesta região 11. Mais tarde, durante a neurogénese embrionário, interneurónios corticais são conhecidos para atravessar a região pial, para além das suas rotas migratórias na zona intermédia e uma zona subventricular 12-14. Durante este período, as células estaminais podem ser cultivadas a partir desta zona e que parece ser um sítio activo de neuro e gliogenesis 5. No cérebro adulto, foi relatado que interneurónios pode ser carregado a partir de progenitores de superfície pial seguinte provocação hipóxica 7. No entanto, a contribuição da região para sua a genensis durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal permaneceu obscura, em parte devido à dificuldade de investigar especificamente esta região 6. No colículo superior, e no córtex cerebral, interneurónios superficiais (ou camada I no córtex) podem modular a saída do circuito de populações de neurónios excitatórios subjacentes e, portanto, contribuir significantly para a função destas estruturas. Em particular, uma camada de interneurônios estão em posição privilegiada para regular o disparo de neurônios ao longo das camadas superiores do córtex cerebral dada a sua ampla conectividade para as camadas superficiais e profundas das colunas corticais 15,16. De maneira similar, interneurons horizontais receber entrada excitatória de fibras corticais e da retina, projeto sobre uma área relativamente grande e são especulado para mediar a inibição de populações neuronais que respondem a estímulos visuais remoto 17,18. Além disso, a sua morfologia é bem adequada para desempenhar um papel potencial na actividade das ondas modelado no desenvolvimento do sistema visual 19. Curiosamente, o desenvolvimento e maturação interneurônio acontece com um grande grau de pós-natal. Além disso, este processo de maturação foi encontrado para ser regulada por actividade neuronal e é, portanto, de um substrato de plasticidade de desenvolvimento ao longo da vida, com consequências sobre a função do circuito de 20,21. Notavelmente, nO promotores são descritos que podem objetivar especificamente essas células transgenicamente. Progenitores em divisão pode ser alvo de retrovírus 7, mas a produção do vírus é demorado e requer habilidade para produzir os títulos elevadas necessárias para a transdução de células.
Eletroporação levou a um renascimento no estudo do desenvolvimento neurológico, pois permite interrogatório genético rápido e eficiente de vias de sinalização das células precursoras neurais 4, 22, 23. A electroporação envolve a injecção de DNA de plasmídeo, seguido pelo fornecimento de impulsos eléctricos para o exterior da cabeça, para conduzir unidireccionalmente do ADN nas células progenitoras que proliferam em torno dos ventrículos 4, 22, 23. Electroporation parece requerer o trânsito de células através da fase M do ciclo celular para a expressão de transgenes de plasmídeo de 24. Especificamente, descobriu-se que somentecélulas que passam por fase M dentro de 8 horas de eletroporação de plasmídeos vai expressar transgenes apesar de sua entrega efetiva de todas as células dentro de ~ 160 mM da parede ventricular 24. Especula-se que isto é devido à necessidade de repartição do envelope nuclear que permite o acesso nuclear dos plasmídeos epissomais, como produtos químicos que provocam a permeabilização nuclear pode induzir a expressão de plasmídeos nas células pós-mitóticas 25. Originalmente utilizada no embrião 22, electroporação foi adaptada para uso no cérebro pós-natal bem mais tarde 26, 27. Recentemente, nós adaptamos electroporação para utilização na manipulação genética de células progenitoras de superfície pial 6. Além disso, usando essa abordagem nós mostramos que há aparentemente duas linhagens distintas de células progenitoras na região-interneuronal e astrocitária 6. Este protocolo detalha uma maneira simples, rápida e poderosa para direcionar essas células para o interrogatóriodo desenvolvimento de mecanismos de regulação destas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O aspecto mais crítico para electroporação bem sucedida de células progenitoras de superfície pial são: 1) a segmentação da mistura de plasmídeo para a superfície pial; 2) evitando a geração de hematoma no local da injecção; e 3) evitar a mortalidade associada com eletroporação mesencéfalo.
Apropriadamente segmentação da superfície pial é conseguido por meio de furos de medição e cuidado do crânio para evitar a penetração da superfície pial. Indevido de direcioname…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o apoio do Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Award Forum, bem como os fundos do Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, ea família de Guerin. O projeto descrito foi apoiado na forma de um voucher CTSI Núcleo financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, Grant UL1RR033176, e agora está no Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Grant UL1TR000124. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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