Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon
Summary
Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.
Abstract
Son birkaç yılda Pial yüzey yaralanma sonrası da dahil olmak üzere, embriyonik perinatal ve yetişkin nöro-ve gliogenesis sırasında önemi bir germinal niş olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, genetik olarak bu hücrelerin popülasyonları sorgulama ve soy izleme için yöntemler, özgünlüğü ya da zaman virüs üretimini tüketen olmaması nedeniyle sınırlı olmuştu. Böylece, bu bölgede ilerleme bu konumu soruşturmaların sadece bir avuç nispeten yavaş olmuştur. Elektroporasyon embriyo nöral kök hücre özelliklerini incelemek için bir on yıl için kullanılan ve son zamanlarda doğum sonrası beyinde olmuştur. İşte biz, bir uyarlanmış elektroporasyon yaklaşıma dayalı pial yüzey atalarıdır genetik manipülasyon için verimli, hızlı ve basit bir teknik açıklar. Pial yüzey elektroporasyon dolayısıyla bu hücrelerin incelenmesi için bir zaman tasarrufu ve ekonomik yaklaşımı temsil eden, bu atalarıdır uyduruk genetik etiketleme ve manipülasyon için izin verir.
Introduction
Sinir kök ve projenitör hücreler, memeli merkezi sinir sistemi 1, 2 mevcut bulunur. Onların doğası ve beyin ve omurilik ventriküler bölgelerini çevreleyen embriyonik ve yetişkin germinal bölgelerinde özellikleri de yoğun geçen on yılda 1-3 belgelenmiştir. Büyük ölçüde, bu nedeniyle böyle floxed alellerin veya 4 izleme retroviral soy sinir sistemi belirli Kre rekombinasyon olarak giderek kesin genetik araçlarının geliştirilmesi olmuştur. Ancak, bir ata bölge Pial yüzey atası sadece son zamanlarda herhangi bir detay 5-7 tarif edilmiş bölge-vardır ve bekliyor kapsamlı inceleme.
Beynin Pial yüzeyi beynin yüzeyine ve çevredeki menenjlerin 8 arasında arabirim olarak tanımlanır. Daha sonra geliştirme, nöroepitel ve sırasında, radyal glial uç ayaklar bu yüzeye 9,10 takmak. Köknar Bazıinsan beyninin nöronal ve birçok mitoz st nöronların bu bölgede 11 'de görülmektedir. Daha sonra, embriyonik nöron sırasında, kortikal nöronlar ara bölge ve subventricular bölge 12-14 kendi göç yolları ek olarak, Pial bölge hareket bilinmektedir. Bu dönemde, kök hücreleri, bu bölgesinden kültürlenebilir ve nöro-ve gliogenesis 5 aktif sitesi olarak görüntülenir. Erişkin beyinde, o internöron hipoksik meydan 7 aşağıdaki Pial yüzey progenitörlerinden doğmuş olabilir bildirilmiştir. Ancak, embriyonik ve postnatal gelişim sırasında genensis için onun için bu bölgenin katkısı nedeniyle özellikle bu bölgeyi 6 araştıran zorluk kısmen belirsiz kalmıştır. Üstün colliculus içinde ve serebral korteks, yüzeysel (ya da kortekste tabaka I) internöron temel uyarıcı nöron popülasyonlarının devre çıkış modüle eden ve bu nedenle signific katkıdaBu yapıların işlevi antly. Özellikle, tabaka 1 internöron kortikal sütun 15,16 yüzeyel ve derin tabakalara göre kapsamlı bağlantı verilen serebral korteksin üst katmanlar boyunca nöronların ateş düzenleyen Başbakan konumda bulunmaktadır. Benzer bir şekilde, yatay internöron nispeten geniş bir alan üzerinde, kortikal ve retinal elyaf, proje uyarıcı girdi almak ve uzak görsel uyaranlara yanıt 17,18 nöron popülasyonlarının inhibisyonunun aracılık ettiği iddia edilmektedir. Ayrıca, kendi morfoloji gelişmekte görme sistemi 19 desenli dalga aktivitesi potansiyel bir rol oynamak için çok uygundur. İlginçtir, interneuron gelişme ve olgunlaşma doğumdan büyük ölçüde olur. Bundan başka, bu olgunlaşma süreci nöronal aktivite ile düzenlenir bulunmuştur ve bu nedenle de fonksiyonu devre 20,21 yaşam boyu sonuçlarıyla gelişim plastisite bir substrattır. Özellikle, no özel promoterler transgenik bu hücreleri hedef olabilir tarif edilmiştir. Bölme progenitörler retrovirüs 7 ile hedef olabilir, ancak virüs üretimi, zaman alıcıdır ve hücre transdüksiyonu için gerekli olan yüksek titrelerini üretmek üzere beceri gerektirir.
Bu sinir progenitörlerin 4, 22, 23, içinde sinyal yollarının hızlı ve etkili genetik sorgulama için izin verdiği Elektroporasyon nörolojik gelişim çalışmada bir rönesans yol açmıştır. Elektroporasyon, tek yönlü olarak ventriküller 4, 22, 23, çevreleyen çoğalan progenitörlerde DNA sürmek için başının dış elektrik darbeleri teslimi takiben plazmid DNA enjeksiyonu, içerir. Elektroporasyon plasmid 24 transgenlerin sentezlenmesi için hücre döngüsüne ait M fazı boyunca hücrelerin geçişini gerekli görünmektedir. Özel olarak, bulunmuştur ki, sadeceplasmidlerin elektroporasyon 8 saat içinde M faz geçen hücreler, ventriküler duvarın 24 ~ 160 um olan tüm hücrelere etkin teslimat rağmen transgenleri ifade edecektir. Nükleer geçirgenliği neden olan kimyasal maddeler postmitotik hücreleri 25 plasmidin sentezlenmesinin uyarılması gibi bu, epizomal plazmidlerin nükleer erişimi için de çekirdek zarı arıza için ihtiyaç nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Başlangıçta embriyo 22 istihdam, elektroporasyon daha sonra 26, 27, doğum sonrası beyin kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Son zamanlarda, yüzey Pial progenitörlerin 6 genetik manipülasyonu kullanmak için elektroporasyon adapte edilmiştir. Bundan başka, bu yaklaşımı kullanarak progenitörlerinin iki ayrı soylar bu bölge-internöronal ve astrositik 6 görünüşe olduğunu göstermiştir. Bu protokol sorgulama için bu hücreleri hedef için basit, hızlı ve güçlü bir şekilde ayrıntılarıBu hücrelerin gelişim düzenleyici mekanizmalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pial yüzey progenitörlerinin başarılı elektroporasyon için en önemli bir yönü vardır: 1) pial yüzeyine plasmid karışımı hedeflenmesi; 2) enjeksiyon sahasında hematom üretilmesini önlemek; ve 3) Ortabeyin elektroporasyon ile ilişkili mortalite kaçınarak.
Uygun Pial yüzeyi hedef Pial yüzeyin nüfuz etmesini önlemek için kafatası ölçülü ve dikkatli bir delik açarak gerçekleştirilir. Hafifçe doku (yani hızlı yeşil deri ve bağ dokusu kafatası üzeri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Cedars-Sinai Rejeneratif Tıp Enstitüsü ve Guerin Ailesinden Samuel Oschin Kapsamlı Kanser Enstitüsü Kanser Araştırma Forumu Ödülü desteğini yanı sıra fon kabul etmek istiyorum. Açıklanan Proje Araştırma Kaynakları, Grant UL1RR033176 için Ulusal Merkezi tarafından finanse edilen bir CTSI Çekirdek Fiş şeklinde desteklenen ve Translational Bilimler, Grant UL1TR000124 ilerlemek için Ulusal Merkezi şimdi de edilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
Riferimenti
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscienze. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
