La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.
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Articolo metodologico
Neonatale Pial elettroporazione Surface
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi anni la superficie piale è stato identificato come una nicchia germinale di importanza durante embrionale, perinatale e adulti neuro-e gliogenesi, compreso dopo l'infortunio. Tuttavia, i metodi per interrogare queste popolazioni geneticamente progenitrici e monitoraggio le loro linee erano limitate a causa della mancanza di specificità o tempo di produzione di virus. Così, i progressi in questa regione è stato relativamente lento con solo una manciata di ricerche di questa posizione. L'elettroporazione è stato utilizzato per oltre un decennio a studiare neurali proprietà delle cellule staminali nell'embrione, e più recentemente nel cervello postnatale. Qui si descrive una tecnica efficiente, rapido e semplice per la manipolazione genetica dei progenitori superficie piale basati su un approccio elettroporazione adeguato. Pial superficie elettroporazione consente per l'etichettatura genetica facile e manipolazione di questi progenitori, rappresentando così un approccio risparmio di tempo ed economico per lo studio di queste cellule.
Introduzione
Cellule staminali e progenitrici neurali sono presenti in tutta la loro SNC 1, 2. La loro natura e le proprietà nelle zone germinali embrionali e adulte che circondano le regioni ventricolari del cervello e del midollo spinale sono stati ampiamente documentati negli ultimi dieci anni 1-3. In gran parte, ciò è dovuto allo sviluppo di strumenti genetici sempre più precisi, come il sistema nervoso specifico Cre ricombinazione degli alleli floxed e lignaggio retrovirale tracciamento 4. Tuttavia, una regione, il progenitore piale progenitore superficie di zona-ha solo stato recentemente descritto in dettaglio 5-7 e attende esame....
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Protocollo
Questa procedura è in conformità con i requisiti Cedars-Sinai IACUC. Gli investigatori dovrebbero garantire l'osservanza IACUC istituzionale prima di procedere. Tutti gli strumenti ei reagenti devono essere sterilizzati prima dell'uso.
1. Preparazione di strumenti, soluzioni, e la miscela di DNA
- Inserire borosilicato lucido tubi capillari di vetro da 100 mm di fuoco in un estrattore micropipetta. Impostare il riscaldamento per consentire tirare ponderata standard per formare la punta di pipetta di circa 17,5 millimetri. Tagliare le punte con forbici chirurgiche taglienti ad una distanza di circa 8-9 mm dall'inizio d....
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Risultati
Pial superficiali risultati elettroporazione nell'espressione di DNA plasmidico in cellule principalmente progenitori-o vicino alla superficie piale 6. Più in particolare, l'orientamento degli elettrodi è fondamentale nel dettare la direzione di movimento plasmide e successiva espressione. Così, in configurazioni a doppio elettrodo, il plasmide è diretto in circa un vettore retta tra l'elettrodo negativo e positivo. Pertanto, se il polo negativo è posta sopra il sito di iniezione e il polo positiv.......
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Discussione
L'aspetto più critico per il successo elettroporazione di cellule progenitrici superficie piale sono: 1) il targeting di mix plasmide alla superficie piale; 2) evitare la generazione di ematomi nel sito di iniezione; e 3) evitando la mortalità associate con elettroporazione mesencefalo.
Opportunamente mira la superficie piale si ottiene punzonamento misurata e attenta del cranio per evitare la penetrazione della superficie piale. Improprio di targeting per la pelle sovrastante o sottosta.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno del Forum Cancer Institute Cancer Research Award Samuel Oschin globale così come i fondi presso l'Istituto di Medicina Rigenerativa del Cedars-Sinai, e la famiglia Guerin. Il progetto descritto è stato sostenuto nella forma di un CTSI Nucleo Voucher finanziato dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca, Grant UL1RR033176, ed è ora presso il Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze traslazionale, di Grant UL1TR000124. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi in borosilicato lucidato a fuoco | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Microiniettore digitale | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generatore | Harvard, strumento BTX Div | 45-0052 | |
| Pinzetta in platino da 3 mm | Apparecchio Harvard, strumento BTX Div | 45-0487 | |
| Gel per elettrodi SignaGel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| tampone Tris-EDTA, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Lampada termica a infrarossi | VWR | 36547-009 | |
| Forbici fini affilate | Strumenti di scienza fine | 14060-09 |
Riferimenti
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.
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Ristampe e permessi
