सभ्य कोशिकाओं में अंतर और बाह्य एस्कोर्बेट के निर्धारण के लिए एक तेजी से और विशिष्ट Microplate परख
Summary
एस्कोर्बेट ही हाल के वर्षों में प्रकाश में आए हैं, जिनमें से कई सेलुलर चयापचय में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यहाँ हम एक मध्यम throughput, सेल संस्कृति में दोनों अंतर और बाह्य एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए विशिष्ट और सस्ती microplate परख का वर्णन.
Abstract
विटामिन सी (एस्कॉर्बेट) केवल हाल के वर्षों में प्रकाश में आए हैं, जिनमें से कई सेलुलर चयापचय में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. मस्तिष्क एस्कॉर्बेट homeostasis के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है कि एक रिश्ता – उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के भीतर, एस्कॉर्बेट न्यूरॉन्स और पड़ोसी astrocytes के बीच एस्कॉर्बेट साइकिल चलाना शामिल है कि एक neuroprotective और neuromodulatory ढंग से काम करता है. इसके अतिरिक्त, उभरते सबूत जोरदार एस्कॉर्बेट प्रतिष्ठित मान्यता प्राप्त है की तुलना में सेलुलर और प्रणालीगत लोहे के चयापचय को विनियमित करने में एक बहुत विस्तृत भूमिका है कि पता चलता है. सामान्य और नियंत्रण मुक्त सेलुलर और जीवधारी शरीर क्रिया विज्ञान में एस्कॉर्बेट का अभिन्न भूमिका की बढ़ती मान्यता अत्यधिक महंगा विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता के बिना क्रियान्वित किया जा सकता है कि मध्यम throughput और उच्च संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक श्रृंखला की मांग करती है. यहाँ हम एक मध्यम प्रवाह के लिए स्पष्ट निर्देश, बो के निर्धारण के लिए विशिष्ट और अपेक्षाकृत सस्ती microplate परख प्रदानसेल संस्कृति में वें अंतर और बाह्य एस्कॉर्बेट.
Introduction
1928 से 1934 के 1 को प्रकाशित पत्र में एस्कॉर्बिक अम्ल (विटामिन सी), और लंबे समय से मांग अल्बर्ट Szent-Györgyi द्वारा "विरोधी स्कर्वीजनक कारक", और दूसरों के रूप में अपनी पहचान की रासायनिक प्रकृति की खोज के इतिहास में मील का पत्थर घटनाओं थे जैव रसायन की. दरअसल, इन खोजों, Szent-Györgyi 1937 में फिजियोलॉजी या चिकित्सा के नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया जा रहा है. पौधे और पशु शरीर क्रिया विज्ञान में एस्कॉर्बेट के लिए भूमिकाओं का कभी विस्तार सूट, साथ ही मानव स्वास्थ्य के लिए योगदान सक्रिय वैज्ञानिक के विषयों होना जारी जांच और विवाद.
एल एस्कोर्बेट एक प्रचुर मात्रा में शारीरिक reductant है और स्तनधारी प्रणालियों में cofactor एंजाइम, और कोलेजन hydroxylation, carnitine और norepinephrine जैवसंश्लेषण, tyrosine चयापचय और पेप्टाइड हार्मोन amidation 2 से जुड़े कई अच्छी तरह से परिभाषित एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए योगदान. दिलचस्प, बढ़ते evidence एस्कॉर्बेट ऐसे hydroxylation में शामिल prolyl और asparaginyl hydroxylases के रूप में अन्य आयरन निर्भर dioxygenases, उत्तेजक और hypoxia-inducible कारक (HIFs) 1α और 2α 3 की लक्षित करने में एक भूमिका निभाता है पता चलता है. एक ताजा रिपोर्ट एस्कॉर्बेट परमाणु hydroxylases, Jumonji सी (JmjC) डोमेन प्रोटीन उत्तेजक में अपनी गतिविधि के माध्यम से chromatin demethylation को प्रभावित करने के माध्यम से टी सेल परिपक्वता में एक भूमिका निभाता है पता चलता है कि; जो बाद की पूरी गतिविधि 4 के लिए एस्कॉर्बेट की आवश्यकता दिखाई देते हैं. दरअसल, एस्कॉर्बेट द्वारा इस तरह के एंजाइम की उत्तेजना HIF और कोलेजन hydroxylases की एस्कॉर्बेट से उत्तेजना के लिए एक समान तंत्र द्वारा घटित होता है. अन्य शास्त्रीय प्रभाव के अलावा, एस्कॉर्बेट एक पानी में घुलनशील चेन तोड़ने कट्टरपंथी मेहतर के रूप में 5 सेलुलर ऑक्सीकरण को रोकना अथवा उसे कम करना करने के लिए और प्लाज्मा झिल्ली की रीसाइक्लिंग के लिए महत्वपूर्ण योगदान α-tocopherol डब्ल्यू, 6 α-tocopheroxyl कट्टरपंथी की कमी के माध्यम से (विटामिन ई)hich झिल्ली लिपिड peroxidation 7 के खिलाफ की रक्षा करने में महत्वपूर्ण है. सबसे स्तनधारियों डी ग्लूकोज से एस्कॉर्बेट की नए सिरे से यकृत संश्लेषण करने में सक्षम हैं, हालांकि महत्वपूर्ण बात है,, उच्च primates, गिनी सूअरों और कुछ चमगादड़ विटामिन 8 की आहार स्रोतों पर निर्भर हैं. इस GULO जीन की निष्क्रियता की वजह से है, अप्रभावित स्तनधारियों में जो की orthologues 9-13 oxidase एंजाइम, γ-gulono-लैक्टोन सांकेतिक शब्दों में बदलना. इस एंजाइम ग्लूकोज 13 से एस्कॉर्बेट biosynthesis में अंतिम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है.
इंसानों में आंतों लुमेन से ट्रांसपोर्टर की मध्यस्थता अवशोषण के बाद, एस्कॉर्बेट संचार प्रणाली से पूरे शरीर में वितरित किया जाता है. विटामिन आमतौर पर (सांद्रता आम तौर पर प्रचलित प्लाज्मा एकाग्रता के समान हैं जिसमें एरिथ्रोसाइट्स की उल्लेखनीय अपवाद के साथ) intracellularly millimolar सांद्रता पर और micromolar सान्द्र में अपनी कम के रूप में पाया जाता हैसबसे बाह्य तरल पदार्थ 14,15 में entrations (जैसे 50-200 माइक्रोन).
शारीरिक शर्तों के तहत, एस्कॉर्बेट आमतौर पर Ascorbyl मुक्त कणों को एक प्रतिवर्ती एक इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण की प्रक्रिया से गुजरते (AFR; भी monodehydroascorbate या semidehydroascorbate के रूप में जाना जाता है). AFR वापस एस्कॉर्बेट को अपनी तेजी से एक इलेक्ट्रॉन एंजाइमी कमी के अभाव में, एक अपेक्षाकृत स्थिर कट्टरपंथी 16 है, वहीं दो AFRs एक एस्कॉर्बेट और एक dehydroascorbate (डीएचए) 9,13,17 को dismutate आगे कर सकते हैं. सेल के इंटीरियर के भीतर, एस्कॉर्बेट, DHA के दो इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण उत्पाद, तेजी से glutathione-और NAD (पी) एच निर्भर एंजाइमी और गैर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं 13 से वापस एस्कॉर्बेट को कम किया जा सकता है.
यह प्रतिष्ठित लोहे के चयापचय में एस्कॉर्बेट की ही महत्वपूर्ण भूमिका गैर heme लोहे 18 के आहार अवशोषण को प्रोत्साहित करने के लिए है कि स्वीकार कर लिया है, वहीं हम और दूसरों के सबूत प्रदान की हैtrongly कि एस्कॉर्बेट सुझाव इस धातु के चयापचय में एक बहुत विस्तृत भूमिका निभाता है. सबसे पहले, एस्कॉर्बेट-परिपूर्ण कोशिकाओं द्वारा जारी की है कि एस्कॉर्बेट कोशिकाओं 19,20 द्वारा गैर transferrin जाने वाली लोहे की तेज नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और बहुत हाल ही में सबूत एस्कॉर्बेट भी transferrin जाने वाली लोहे की तेज modulates इंगित करता है कि प्रतीत होता है कोशिकाओं 21 से, जिनमें से बाद के एक प्रमुख शारीरिक लौह तेज मार्ग 22 से मेल खाती है.
एस्कोर्बेट स्तनधारियों 23,24 में सामान्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए आवश्यक है. साथ में अधिवृक्क प्रांतस्था, पिट्यूटरी ग्रंथि, थाइमस, रेटिना और पीत – पिण्ड के साथ, मस्तिष्क शरीर के अन्य ऊतकों 23,25-27 को एस्कॉर्बेट रिश्तेदार की उच्च सांद्रता शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, astrocytes 28,29 और न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह ग्लूटामेट 30 दोनों के लिए जोखिम जहां ascorbat बाह्य अंतरिक्ष में एस्कॉर्बेट की रिहाई को ट्रिगर करने के लिए जाना जाता हैई ग्लूटामेट प्रेरित neuronal शिथिलता 31 के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा में मदद करने के लिए सोचा है. Astrocytes से ग्लूटामेट प्रेरित एस्कॉर्बेट रिहाई की सटीक व्यवस्था अज्ञात है, हम हाल ही में astrocyte ग्लूटामेट और एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर (GLAST द्वारा ग्लूटामेट तेज की वजह से सूजन सेल की भागीदारी का संकेत सबूत प्रदान की है, यह भी जाना जाता है उत्तेजक अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर isoform 1 [EAAT1 ] मानव में) और इस तरह एस्कॉर्बेट 32 के रूप में छोटे कार्बनिक anions को पारगम्य हैं कि मात्रा के प्रति संवेदनशील osmolyte और आयनों चैनल (VSOACs) के फलस्वरूप सक्रियण. VSOAC गठन में शामिल प्लाज्मा झिल्ली conduits के आणविक पहचान 33,34 पहचाना जा रह है.
कई assays, spectrophotometric fluorometric और chromatographic assays 35,36 में शामिल हैं जो जैविक नमूने में एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए विकसित किया गया है, विशिष्टता, संवेदनशीलता, interferenc में ज्यादा परिवर्तनशीलता हैरासायनिक contaminants, प्रभावी रैखिक सीमा और समापन बिंदु analyte की स्थिरता से ई. इसके अतिरिक्त, परख के चुनाव को प्रभावित करने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारकों तेज़ी, उपयोग की आसानी और इस तरह के एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) उपकरण के रूप में अपेक्षाकृत विशेष उपकरणों के लिए उपयोग कर रहे हैं.
यहाँ हम सभ्य कोशिकाओं में intracellular एस्कॉर्बेट का दृढ़ संकल्प है, साथ ही संवर्धित कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट-तपका के निर्धारण के लिए एक अलग परख के लिए एक सरल और अति विशिष्ट वर्णमिति microplate परख उपस्थित थे. उत्तरार्द्ध परख के कारण सोडियम निर्भर एस्कॉर्बेट ट्रांसपोर्टरों (SVCTs) द्वारा जारी एस्कॉर्बेट के तेजी से फिर से तेज करने के लिए कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट रिहाई के मूल्यवान समझना की समस्या को दरकिनार करना है. इन तरीकों के दोनों हमारे पिछले प्रकाशनों 19,20,32,37,38 में से कुछ में दिखाई दिया है, यद्यपि यह पांडुलिपि निर्देश और उनके प्रभावी क्रियान्वयन के लिए दिशा निर्देशों का एक स्पष्ट सेट प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में हम सभ्य कोशिकाओं में अंतर और बाह्य डिब्बों से व्युत्पन्न एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए दो, तेजी से विशिष्ट और अपेक्षाकृत संवेदनशील वर्णमिति microplate assays प्रस्तुत करते हैं. assays मानक प्रयोगशाला क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम astrocyte संस्कृतियों के उदार आपूर्ति के लिए डॉ. स्टीफन रॉबिन्सन और सुश्री Hania Czerwinska (मोनाश विश्वविद्यालय) के लिए आभारी हैं.
Materials
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
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