Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias
Summary
We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.
Abstract
Reconstrucción volumen Histología facilita el estudio de la forma 3D y el cambio de volumen de un órgano a nivel de macro-estructuras formadas por células. También se puede utilizar para investigar y validar nuevas técnicas y algoritmos en imágenes médicas volumétrica y terapias. La creación de los atlas 3D de alta resolución de los diferentes órganos 1,2,3 es otra aplicación de la reconstrucción del volumen histología. Esto proporciona un recurso para la investigación de las estructuras de tejido y la relación espacial entre diferentes características celulares. Presentamos un método de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histología, que utiliza un conjunto de imágenes blockface ópticos. El volumen histología reconstruida representa una forma fiable de la muestra procesada sin error de registro post-procesamiento propagado. Los hematoxilina y eosina (H & E) manchadas secciones de dos glándulas mamarias de ratón se registraron a sus imágenes blockface correspondientes utilizando puntos de los límites extraídos del edbios de la muestra en la histología y blockface imágenes. La precisión del registro se evaluó visualmente. La alineación de las macroestructuras de las glándulas mamarias también se evaluó visualmente en alta resolución.
Este estudio delinea las diferentes etapas de esta tubería de registro de imágenes, que van desde la escisión de la glándula mamaria a través de volumen histología reconstrucción 3D. Mientras que las imágenes de histología 2D revelan las diferencias estructurales entre pares de secciones, el volumen de la histología en 3D proporciona la capacidad de visualizar las diferencias en la forma y el volumen de las glándulas mamarias.
Introduction
IGFBP7 (la insulina como factor de crecimiento de la proteína de unión a 7) es un miembro de la familia de proteínas de unión de IGF-, y se ha demostrado que se unen al receptor de IGF1 4. Down-regulación de IGFBP7 se sabe que se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de mama 5, mientras que la reintroducción de IGFBP7 en modelos de tumores de xenoinjertos inhibe en gran medida los tumores de crecimiento 6 a través de la inducción de la apoptosis y senescencia celular 7. Con el fin de estudiar los efectos de IGFPB7, un ratón-IGFBP7 nula fue creado 5 (datos no publicados). Mientras que estos ratones no desarrollan tumores, que muestran cambios en la histología del ovario, músculo y el hígado, así como defectos en los patrones de desarrollo de la glándula mamaria (datos no publicados). El fenotipo defectuoso fue indicado por primera vez como los ratones nulos tienen camadas más pequeñas y no son capaces de sostener múltiples camadas grandes (datos no publicados).
Volúmenes de histología en 3D tienen el potencial de proporcionar Informat útilion para los análisis cuantitativos y comparativos y la evaluación de los hallazgos patológicos en las imágenes médicas volumétricas. Confocal tridimensional, la microscopía de dos fotones puede proporcionar células de alta resolución información morfológica de la glándula en extensión local 14, pero tiene un campo de visión limitado y profundidad. Reconstrucción volumen Histología proporciona más información sobre un mucho mayor extensión espacial. El uso de los enfoques tradicionales se prevé cierta distorsión durante la preparación de los cortes histológicos, tales como contracción, expansión, las lágrimas, y los pliegues. Estas distorsiones hacen que sea difícil para registrar imágenes histológicas de serie en una pila 3D para reconstruir un volumen 3D. Como el número de secciones consecutivas con defectos aumenta las similitudes entre las secciones intactas se reduce y por lo tanto hace que el proceso de registro más complicado.
Se han propuesto diferentes métodos para registrar las secciones histológicas y para crear un VO histología continuolume. Algunas técnicas dependen de variaciones de intensidad 8, y otros se basan en la forma de las secciones 9. Para algunas muestras de las estructuras anatómicas se pueden utilizar como puntos de referencia 10,11, junto con métodos de registro basado-hito 12,13. Pero estas estructuras internas podrían no ser detectables a través de todo el volumen y para algunos especímenes no hay estructuras anatómicas confiables pueden ser identificados. Algunos grupos han utilizado un enfoque de registro de pares y registrado histología imágenes consecutivas de uno a otro utilizando contornos o estructuras anatómicas 16-18. Registro de secciones histológicas de serie el uno al otro sin el uso de imágenes de referencia puede propagar error de registro y cambiar la forma real del volumen de la histología. Enfoque de registro por pares se basa en la consistencia de la forma de las secciones de histología y las estructuras internas a lo largo de la pila de las imágenes; por lo tanto, requiere densa de muestreo de la muestra, la cualno siempre es posible, por ejemplo, para las muestras clínicas.
En este gasoducto utilizamos imágenes blockface como un conjunto de imágenes de referencia para la reconstrucción del volumen histología 19. Imágenes Blockface se toman de los bloques de parafina de tejidos después de su montaje en el microtomo y antes se corta cada sección. Por lo tanto, el daño a individuo corte secciones en serie no interfiere con el registro de las secciones de serie 8,11,15. Capturamos las imágenes blockface de una manera diferente a los otros grupos. Las imágenes de la cara del bloque óptico se obtienen mediante un objetivo telecéntrico para eliminar o minimizar el cañón y la perspectiva de la distorsión, que generalmente ocurre cuando se utilizan objetivos regulares en la óptica. Esta es una de las ventajas del enfoque propuesto sobre los otros métodos publicados, que realizan de imágenes blockface usando lentes regulares. Las imágenes son tomadas en un ángulo oblicuo de leve a utilizar la reflexión de la superficie del bloque para el aumento del contraste entre el TISSsuperficie UE y de parafina y para eliminar la sombra del tejido en profundidad, bajo la superficie de parafina. Un filtro fotográfica también se utiliza para polarizar la luz procedente de la superficie del bloque y el tejido para equilibrar el contraste 19. Para corregir para el desplazamiento del bloque en el micrótomo rotatorio, de dos a tres agujeros son perforados en las esquinas del bloque, que son fácilmente detectables en las imágenes blockface. Los centroides de estos agujeros se utilizan junto con el registro rígido basado en hito para alinear las imágenes blockface.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos desarrollado un flujo de trabajo de registro de imágenes para reconstruir un volumen histología en 3D a partir de imágenes de histología en 2D de serie, que no requieren puntos de referencia internos seleccionados al azar o marcadores fiduciales implantados dentro del tejido, que puedan distorsionar el tejido. Mediante el método descrito, imágenes blockface ópticos mismos se utilizan como imágenes de referencia antes de seccionar. Utilizamos orificios externos perforados en el bloque de pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.
Materials
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 Automated Tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast Tissue Embedding Medium |
| Leica EG 1160 Embedding Centre | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
Riferimenti
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