Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata
Summary
L'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC) direttamente da tessuti umani è necessaria per la loro caratterizzazione biologica. Questo manoscritto descrive una metodologia per l'isolamento di CSC prostata da tessuti umani, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei problemi passi difficili.
Abstract
Il modello di cellule staminali cancerose (CSC) è stato notevolmente rivisitato nel corso degli ultimi due decenni. Durante questo periodo CSC sono stati identificati e direttamente isolato da tessuti umani e serialmente propagate in topi immunodeficienti, tipicamente attraverso l'etichettatura degli anticorpi di sottopopolazioni di cellule e frazionamento di citometria a flusso. Tuttavia, le caratteristiche cliniche uniche di cancro alla prostata hanno notevolmente limitato lo studio di CSC prostata da campioni freschi di tumori umani. Recentemente abbiamo riportato l'isolamento di CSC prostata direttamente da tessuti umani in virtù del loro fenotipo HLA di classe I (HLAI)-negativo. Le cellule tumorali della prostata vengono raccolte da campioni chirurgici e dissociate meccanicamente. Una sospensione cellulare viene generato ed etichettato con anticorpi HLAI e stromali coniugati modo fluorescente. Sottopopolazioni di cellule HLAI-negativi sono finalmente isolate utilizzando un citometro a flusso. Il limite principale di questo protocollo è la natura frequentemente microscopica e multifocaletumore primario nei campioni prostatectomia. Tuttavia, isolato CSC prostata dal vivo sono adatti per la caratterizzazione molecolare e validazione funzionale da trapianto in topi immunodeficienti.
Introduction
Eterogeneità intratumorale è considerata una caratteristica del cancro 1. Infatti, sono stati descritti diversi meccanismi di eterogeneità intratumorale, inclusi la mutazione genetica e interazioni con il microambiente. Inoltre, alcuni tipi di cancro possono contenere una gerarchia cellulare con una sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che presenta le caratteristiche di capacità del tumore di avvio e di auto-rinnovamento in saggi di trapianto di serie 2-5. Inizialmente descritto in ematologica 6, seno 7, 8 e cervello neoplasie, CSC sono stati studiati anche nel cancro della prostata 9-12 così come altri tipi di tumore 2-5.
CSC sono generalmente considerati una frazione cellulare all'interno di una popolazione eterogenea 2-5. Pertanto, la caratterizzazione funzionale e molecolare di CSC è subordinato al loro arricchimento da popolazioni di massa. Di conseguenza, nel corso degli ultimi due decenni vari soddisfattehodologies di CSC arricchimento sono stati inventati che in genere comportano la separazione delle popolazioni etichettati mediante citometria a flusso. Inoltre, una considerazione importante nello studio di CSC è che l'organizzazione gerarchica dei tessuti umani può essere interrotta da manipolazioni sperimentali come passaging seriale in coltura o immunodeficienti topi. Come risultato, l'isolamento diretto di CSC da tessuti umani è emerso come una metodologia importante nel campo CSC.
Il cancro della prostata è una delle principali cause di morbilità e mortalità negli Stati Uniti e in tutto il mondo 13 cancro. Pertanto, l'isolamento e la caratterizzazione biologica di CSC prostata è di notevole interesse. CSC prostata sono stati precedentemente arricchiti da linee cellulari, paziente derivati xenotrapianti e basso passaggio del paziente derivata sospensione culture 9,10,12,14.
Recentemente abbiamo riportato l'isolamento di CSC prostata direttamente da s chirurgici umaniamples in virtù della loro HLAI-negativi superficie delle cellule fenotipo 10. Qui abbiamo dettagliato le procedure adottate per l'isolamento di queste cellule. Tumori della prostata vengono raccolte da campioni chirurgici e trasformate in sospensioni cellulari. Le cellule vengono poi colorate con anticorpi contro HLAI nonché stromali e vitalità marcatori, e CSC sono isolati dalla fluorescenza attivato cell sorting (FACS). Isolato CSC possono quindi essere utilizzate per saggi richiedono cellule vitali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l'isolamento di CSC da tessuti tumorali della prostata umana freschi. Diverse considerazioni importanti influenzano l'esito positivo di questo protocollo.
Il recupero di un numero elevato di cellule tumorali della prostata vitali dipende da un'attenta valutazione al lordo dei campioni chirurgici. Nella nostra esperienza, l'isolamento di successo delle cellule prostatiche tumorali è meglio garantita quando i noduli tumorali macroscopici sono osserva…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Hariri Famiglia e la Fondazione TJ Martell.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
Riferimenti
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