ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

Summary

直接ヒト組織からがん幹細胞（CSCが）の単離は、それらの生物学的特性評価のために必要である。また、難しい手順のトラブルシューティングのヒントを提供しながら、この原稿は、ヒト組織からの前立腺のCSCを単離するための方法論を説明します。

Abstract

癌幹細胞（CSC）のモデルはかなり過去20年間に再訪されています。この時間の間のCSCを同定し、直接単離されたヒト組織から直列典型的にフローサイトメトリーによる細胞分画の亜集団の抗体標識を介して、免疫不全マウス中で増殖されている。しかし、前立腺癌の独特の臨床的特徴は、かなり新鮮なヒト腫瘍試料から前立腺のCSCの研究が限られている。我々は最近、HLAクラスI（HLAI）のおかげで、直接ヒト組織由来の前立腺のCSCの分離陰性の表現型を報告した。前立腺癌細胞は、手術標本から採取し、機械的に解離される。細胞懸濁液が生成され、蛍光共役HLAIおよび間質抗体で標識される。 HLAI陰性細胞の亜集団は、最終的にフローサイトメーターを用いて単離される。このプロトコルの主な制限は、頻繁に微視的および多発性性質である前立腺切除標本における原発性癌。それにもかかわらず、孤立したライブ前立腺CSCは免疫不全マウスでの移植による分子特性および機能検証に適しています。

Introduction

腫瘍内不均一性癌¹の特徴であると考えられている。実際、腫瘍内の不均一性のいくつかのメカニズムは、遺伝子変異と微小環境との相互作用を含む、記載されている。さらに、いくつかの癌は、連続移植アッセイ^2-5における腫瘍開始能力および自己再生の性質を示す癌幹細胞（CSCが）の亜集団を有する細胞の階層を含むことができる。最初に血液学^6、7乳房、および脳⁸に記載の悪性腫瘍、CSCはまた、前立腺癌の^9-12、ならびに他の腫瘍タイプ^2-5に研究されている。

CSCは、一般的に不均一な集団^2-5内細胞画分と見なされます。したがって、CSCが機能的分子特性は、バルク集団からの濃縮条件とする。したがって、最後の二十年の間に数が満たさCSCの濃縮のhodologiesは、典型的には、フローサイトメトリーによって標識された集団の分離を伴うが考案されてきた。また、CSCが研究で重要な考慮事項は、ヒト組織の階層的な組織がそのような文化や免疫不全マウスでの連続継代として実験操作によって破壊され得ることである。その結果、ヒト組織からのCSCの直接単離は、CSCの分野で重要な方法論として浮上している。

前立腺癌は、癌の罹患率および米国および世界中¹³の周り死亡の主要な原因である。従って、前立腺のCSCの単離および生物学的特徴付けは重要な関心である。前立腺CSCは、以前の細胞株、患者に由来する異種移植片、および低継代患者派生懸濁培養^9,10,12,14から濃縮されています。

我々は最近、直接人間の外科sから前立腺のCSCの単離を報告そのHLAI陰性細胞表面表現型¹⁰のおかげでamples。ここでは詳細は、これらの細胞の単離のための手順を実装WE。前立腺腫瘍は、手術標本から採取し、細胞懸濁液中に形成されている。次いで、細胞をHLAIに対する抗体ならびに間質および生存度マーカーを用いて染色し、CSCは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）により単離される。単離されたCSCはその後、生細胞を必要とするアッセイに用いることができる。

Protocol

1。手術標本からのヒト前立腺癌組織の収穫と処理ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640を15mlの10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した培養培地および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む二つの50ミリリットルポリスチレンコニカルチューブを準備する。 治験審査委員会は、プロトコルを承認の下で病理サービス担当者は、それぞれ、前立腺切除および緩和手術標本から原発…

Representative Results

図1。ヒト前立腺癌腫瘍を収穫し、ヒト前立腺癌の特定の集団を示すフローサイトメトリープロット。（A）腫瘍結節細胞懸濁液を生成するために収穫される。処理された試料の腫瘍含有量は、従来のヘマトキシリン​​及びエオシン染色を用?…

Discussion

このプロトコルは、新鮮なヒト前立腺癌組織からのCSCの単離を記載している。いくつかの重要な考慮事項は、このプロトコルの成功結果に影響を与える。

生存可能な前立腺癌細胞の高い数の回復は、外科的試料を慎重に肉眼的評価に依存する。巨視的腫瘍結節が観察され^、10を処理する際に我々の経験では、腫瘍形成性前立腺細胞の正常なアイソレーションが最?…

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480