Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

Summary

Isoleringen av cancer stamceller (CSCs) direkt från mänskliga vävnader är nödvändiga för deras biologiska karakterisering. Detta manuskript beskriver en metod för isolering av prostata CSCs från mänskliga vävnader, och samtidigt ge tips om felsökning svåra steg.

Abstract

Cancern stamcell (CSC) modell har avsevärt revisited under de senaste två decennierna. Under denna tid CSCs har identifierats och direkt isolerat från mänskliga vävnader och seriellt förökat i immundefekta möss, vanligtvis genom antikropps märkning av subpopulationer av celler och fraktionering genom flödescytometri. Däremot har de unika kliniska funktionerna i prostatacancer avsevärt begränsade studier av prostata CSCs från färska humana tumörprover. Vi rapporterade nyligen isoleringen av prostata CSCs direkt från humana vävnader på grund av deras HLA klass I (HLAI)-negativ fenotyp. Prostatacancerceller skördas från kirurgiska prover och mekaniskt dissocierade. En cellsuspension genereras och märkta med fluorescerande konjugerade HLAI och stromal antikroppar. Subpopulationer av HLAI negativa celler isolerades slutligen med hjälp av en flödescytometer. Den främsta begränsningen av detta protokoll är det ofta mikroskopiska och multifokal naturprimär cancer i prostatectomy prover. Icke desto mindre, isolerade levande prostata CSCs är lämpliga för molekylär karakterisering och funktionell validering av transplantation i immundefekta möss.

Introduction

Intratumoral heterogenitet anses vara ett kännetecken för cancer ^1. I själva verket har flera mekanismer för intratumoral heterogenitet beskrivits, inklusive genetisk mutation och interaktion med mikromiljö. Dessutom kan vissa cancer innehålla en cellulär struktur med en subpopulation av cancer stamceller (CSCs), som uppvisar egenskaperna hos tumör-initierande kapacitet och självförnyelse i seriell transplantation analyser ^2-5. Inledningsvis beskrivs i hematologiska ^6, bröst ^7, och hjärna ⁸ maligniteter har CSCs också studerats i prostatacancer ^9-12 samt andra tumörtyper ^2-5.

CSCs är allmänt som en cellulär fraktion inom en heterogen population ^2-5. Därför är det funktionella och molekylär karakterisering av CSCs avhängigt deras anrikning från bulk populationer. Således, under de senaste två decennierna flera uppfyllshodologies av CSC anrikning har uppfunnits, som typiskt omfattar separation av märkta populationer med flödescytometri. Dessutom är en viktig fråga i studien av CSCs att den hierarkiska organisationen av mänskliga vävnader kan störas av experimentella manipulationer såsom seriepassage i kultur-eller immundefekta möss. Som en följd av detta har direkt isolering av CSCs från mänskliga vävnader vuxit fram som en viktig metod i CSC området.

Prostatacancer är en ledande orsak till cancer sjuklighet och dödlighet i USA och runt om i världen ^13. Därför är isolering och biologisk karakterisering av prostata CSCs av betydande intresse. Prostata CSCs har tidigare berikats från cellinjer, patient härrör xenografter och låg passage patienten härstammar suspensionskulturer ^9,10,12,14.

Vi rapporterade nyligen isolering av prostata CSCs direkt från humana kirurgiska sempel på grund av deras HLAI negativa cellytan fenotyp ^10. Här är vi i detalj de förfaranden som genomförts för isolering av dessa celler. Prostatatumörer skördas från kirurgiska prover och göras till cellsuspensioner. Celler färgas sedan med användning av antikroppar mot HLAI liksom stromala och genomförbarhet markörer och CSCs isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Isolerat CSCs kan sedan användas för analyser som kräver viabla celler.

Protocol

1. Skörd och bearbetning av Human Prostate Cancer Vävnad från kirurgiska preparat Bered två 50 ml polystyren koniska rör som innehåller 15 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Patologi servicepersonal skörda primära och metastaserande prostatacancer prover från prostatektomi och palliativ kirurgi exemplar, respektive, enligt en Institutional Review Board godkänt protokoll. Metastatis…

Representative Results

Figur 1. Human prostatacancer tumör skörd och flödescytometri tomt illustrerar specifika populationer från en mänsklig prostatacancer. (A) tumörnoduli skördas för att generera en cellsuspension. Tumörhalten i det behandlade provet bekräftas med hjälp av konventionella hematoxylin och eosin färgning. (…

Discussion

Detta protokoll beskriver isolering av CSCs från färska human prostatacancer vävnad. Flera viktiga faktorer påverkar det framgångsrika resultatet av detta protokoll.

Återhämtningen av ett högt antal viabla prostatacancerceller är beroende av noggrann grov bedömning av kirurgiska prover. Enligt vår erfarenhet är det framgångsrika isoleringen av tumörframkallande prostataceller bäst garanteras när makroskopiska tumörnoduli observeras och behandlas ^10.

<p class="…

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480