اللجنين أسفل تنظيم<em> ذرة شامية</em> عبر dsRNAi وKlason تحليل اللجنين
Summary
يتم توظيف تدخل الحمض النووي الريبي مزدوج تقطعت بهم السبل (dsRNAi) تقنية لأسفل تنظيم أنزيم الذرة السنامويل واختزال (ZmCCR1) الجينات إلى انخفاض محتوى اللجنين النبات. هو تصور اللجنين أسفل التنظيم من جدار الخلية بواسطة التحليلات المجهرية وكميا من خلال طريقة Klason. يتم تحليل التغيرات التركيبية في هيميسيلولوز والسليلوز البلورية.
Abstract
لتسهيل استخدام الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية كمصدر للطاقة الحيوية البديلة، أثناء عمليات التحويل البيولوجي، هناك حاجة إلى خطوة المعالجة لفتح هيكل جدار الخلية النباتية، وزيادة إمكانية الحصول على الكربوهيدرات جدار الخلية. ومن المعروف اللجنين، والمواد بولفنوليك موجودة في العديد من أنواع جدار الخلية، ليكون عائقا كبيرا لانزيم الوصول. انخفاض في محتوى اللجنين إلى المستوى الذي لا يتعارض مع سلامة والدفاع النظام الهيكلي للمحطة قد تكون خطوة قيمة لتقليل تكاليف الإنتاج الإيثانول. في هذه الدراسة، ونحن قد وراثيا أسفل تنظيم واحد من الجينات ذات الصلة الحيوي اللجنين،-السنامويل جنة الزراعة اختزال (ZmCCR1) الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي عبر تقنية التدخل مزدوجة. تم دمج بناء ZmCCR1_RNAi في جينوم الذرة باستخدام طريقة الجسيمات القصف. نمت النباتات المعدلة وراثيا الذرة عادة بالمقارنة مع محطات التحكم من النوع البري دون فيterfering مع نمو الكتلة الحيوية أو آليات الدفاع، باستثناء عرض من البني التلون في النباتات المعدلة وراثيا ورقة منتصف الأضلاع، قشور، وينبع. التحليلات المجهرية، بالتزامن مع الفحص النسيجي، وكشفت أن ألياف نسيج خشبي ورقة وضعفت ولكن لم يتم تغييرها هيكل وحجم مكونات نظام الأوعية الدموية الرئيسية الأخرى. تم خفض محتوى اللجنين في الذرة المعدلة وراثيا عن طريق 7-8،7٪، وزيادة محتوى السليلوز البلورية في الاستجابة للحد من اللجنين، وظلت hemicelluloses دون تغيير. قد تشير التحليلات قد تم نقل هذا التدفق الحيوي الكربون من اللجنين إلى السليلوز الحيوي. يحدد هذا المقال الإجراءات المستخدمة لأسفل تنظيم محتوى اللجنين في الذرة عبر تقنية رني، والتركيبية جدار الخلية التحليلات المستخدمة للتحقق من تأثير التعديلات على هيكل جدار الخلية.
Introduction
إنتاج الوقود الحيوي من الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية مرغوب فيه للغاية بسبب وفرة الحالي في الولايات المتحدة 1، وفي حالة الحصاد المستدام للمخلفات الزراعية والغابات، والقدرة على المنافسة وليس مباشرة عن الأراضي الزراعية المستخدمة في إنتاج الأعلاف الغذائية والحيوانية. ولكن، خلافا للحبوب الذرة، والذي هو المصدر الرئيسي للوقود الحيوي ولدت في الولايات المتحدة حاليا، ومواد اللجنوسليلوزية بشكل ملحوظ أكثر تعقيدا وصعوبة لكسر. بالإضافة إلى الكربوهيدرات طويلة السلسلة، السليلوز وهيميسيلولوز، والتي هي المصادر الرئيسية للسكريات أثناء تخمير المواد اللجنوسليلوزية، وأنواع عديدة من جدران الخلايا النباتية تحتوي أيضا على اللجنين، البوليمر phenylpropanoid أن يوفر قوة، والدفاع ضد أي هجوم الممرض، وللا مائية إلى الخلية الجدران. في حين اللازمة لنمو النبات والبقاء على قيد الحياة، ويعرض اللجنين أيضا حاجزا كبيرا أمام تحويل الأنزيمية ناجحة من السليلوز وhemicelluتفقد السكريات قابل للذوبان. مواد ذات محتويات عالية اللجنين عادة مواد اقل من المرغوب فيه لكل من الوقود الحيوي (من خلال مسارات التحويل البيولوجية) والصناعات اللب والورق ويرجع ذلك إلى آثار سلبية على خصائص تجهيز وجودة المنتج. وبالتالي، والتلاعب الجيني للمواد النباتية للحد من اللجنين في المستوى الذي لا يتعارض مع المحاصيل القوة الهيكلية وأنظمة الدفاع قد يكون من المهم للحد من تكاليف الإنتاج لكل من الوقود الحيوي اللجنوسليلوزية والصناعات اللب والورق.
في الذرة (ذرة شامية)، اللجنين هو تساهميا ربط مرجعية إلى هيميسيلولوز في جدار الخلية الأولية عبر ferulate والجسور diferulate 2. مجمع اللجنين-هيميسيلولوز بربط سيليلوز microfibrils من خلال السندات الهيدروجين، وتشكيل المصفوفة المعقدة التي تمنح النزاهة والقوة لجدار الخلية الثانوية. يتم تحديد القوة الميكانيكية من جدران الخلايا النباتية إلى حد كبير من نوع ليثيومgnin مفارز 3-5. في الدراسات السابقة، وتغيير نسب مفارز اللجنين لم يظهر أي اتجاه واضح على هضم الأنزيمية 6-11. ومع ذلك، تخفيضات في محتوى اللجنين تظهر عادة تحسنا في التحويلات 12،13 ويمكن أن يكون المفتاح لزيادة هضم المواد النباتية من الانزيمات حلمهي بما في ذلك endocellulases، cellobiohydrolases، وβ-glucosidases 14.
وقد مارست الهندسة الوراثية لتنظيم مستوى التعبير النصوص على نطاق واسع لتحسين خصائص المحصول. التقنيات المتقدمة، بما في ذلك مكافحة الشعور 15 وشارك في قمع 16 التقنيات وتمكين فعالة أسفل تنظيم الجينات المستهدفة. كما تم تحقيقها كاملة الجين المغلوب من استخدام التركيبات الجين ترميز تقسم إنترون RNA مع هيكل دبوس 17. علاوة على ذلك، ضعف تدخل الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل (dsRNAi) تقنية، أي وسائل الإعلام التعبير الجيني قوية وفعالةتور التي تعمل إما عن طريق استهداف تدهور نص أو ترجمة القمع، يوفر وسيلة فعالة للحث على مجموعة واسعة من آثار القمع على مرنا 18 هدفا. تظهر تقنيات الجينات إسكات العديد من القيود. هذه التقنيات لا تنظم بدقة مستوى النسخ وأنها يمكن أن تتسبب في آثار غير متوقعة على إسكات الجينات المتماثلة الأخرى.
في هذه الطريقة، ونحن العاملين الجسيمات القصف لحمل dsRNAi يبني في جينوم الذرة. حتى الآن، مجموعة واسعة من الأنواع النباتية تم تحويلها بنجاح باستخدام القصف الجسيمات، الأجرعية بوساطة التحول، التثقيب الكهربائي، وطرق حقن مكروي. في الذرة التحول الوراثي، وطريقة الجسيمات القصف هو مفيد على كل الطرق الأخرى لأنه هو الأكثر كفاءة. الجسيمات القصف لا يتوقف على البكتيريا، لذلك فإن هذه الطريقة خالية من القيود البيولوجية مثل حجم الجينات، نوعا من الجينات أوigin، أو التركيب الوراثي النباتي. نظام تسليم التحوير المادي تمكن عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي والجينات متعددة ليتم إدخالها في الجينوم المصنع، وفي بعض الحالات في البلاستيدات الخضراء في ارتفاع كفاءة تحويل 19. يمكن تصور الحد اللجنين في الأوعية الدموية للأوراق منتصف الضلع عبر المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) الذي يفيد في دراسة التضاريس وتكوين العينات.
في النباتات الذرة، وهما من اختزال السنامويل، لجنة الزراعة تم العثور على الجينات في الجينوم الذرة 20 (ZmCCR1: Y15069: X98083 وZmCCR2). السنامويل، لجنة الزراعة اختزال يحفز تحويل استرات hydroxycinnamoyl، لجنة الزراعة في الألدهيدات سيناميل. اخترنا هذا الجين ZmCCR1 إلى أسفل تنظيم هذا الانزيم لأنه أعرب عن الجينات في جميع الأنسجة lignifying. تم اختيار 523 النيوكليوتيدات في محطة 3 'من الجين ZmCCR1 لبناء dsRNAi لأن تسلسل يبدو أنأكثر تنوعا بالمقارنة مع تلك التي ZmCCR2. وبالتالي، فإن بناء dsRNAi ربط بدقة فقط لZmCCR1، وتجنب خارج الهدف إسكات 21. تم تصميم وبناء ZmCCR1_RNAi في هيولي نظام التعبير ImpactVector1.1 علامة (IV 1.1) تحتوي على مروج خضراء محددة الأنسجة، ريبولوز-1، 5 bisphosphate أوكسيجيناز كربوكسيلاز (RuBisCO).
لدراسة الآثار المترتبة على dsRNAi بناء على النباتات المعدلة وراثيا، وكان كميا محتوى اللجنين. ومن المعروف أن Klason (حمض غير قابلة للذوبان) قياس اللجنين أن تكون أكثر دقة بالمقارنة مع الأساليب المنظفات اللجنين الكمي الحمضية التي ذوبان بعض اللجنين 22. لذلك، تم قياس اللجنين Klason في سيقان الذرة المعدلة وراثيا. يتكون هذا الإجراء من التحلل حمض خطوتين الذي يحول الكربوهيدرات إلى البوليمرية القابلة للذوبان السكريات الأحادية 23. ثم مجزأة الكتلة الحيوية تحلل إلى حمض العتاد القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبانوقد تم قياس المرض واللجنين غير قابلة للذوبان حمض فقا لدراسات سابقة 23،24. من الناحية المثالية، ينبغي تحليل اللجنين تشمل الاستخراج بالماء والإيثانول قبل الخطوة التحلل، وذلك لإزالة المواد القابلة للذوبان التي يمكن أن تتداخل مع النتائج، واحتراق آخر التحلل من بقايا اللجنين لحساب أي الرماد موجودة في بقايا. من دون هذه الخطوات، ومحتوى اللجنين من العينة يمكن أن يكون مبالغا بشكل مصطنع. ويقدم طريقة كاملة هنا، ولكن لتجاربنا كنا غير قادر على أداء كل من هذه الخطوات نظرا لصغر حجم المواد المتاحة للاختبار
وقد تم تحليل اثنين من غيرها من مكونات جدار الخلية، والسليلوز وهيميسيلولوز أيضا في اللجنين أسفل تنظيم خطوط الذرة المعدلة وراثيا. وقد أفيد أن النباتات المعدلة وراثيا التي تم تنظيمها إلى أسفل إما على الفينيل ألانين الأمونيا لياز (PAL) 25، 4 coumarate: التميم يغاز (4CL) 26، أو سيناميل لنازعة lcohol (CAD) 27 تظهر زيادة في المكونات الهيكلية جدار الخلية الأخرى. كخطوة أولى في دراساتنا، وقد تم قياس البلورية السليلوز باستخدام طريقة Updegraff 28. هذه الطريقة تم وضعها أصلا لتحديد السليلوز في عدد كبير من البكتيريا والفطريات cellulolytic. لفترة وجيزة، تم علاج مخزونات الذرة المطحونة مع Updegraff كاشف (حمض الخليك: حامض النيتريك: الماء) لإزالة هيميسيلولوز، اللجنين، وxylosans. وتحلل السليلوز البلورية تماما إلى جلوكوز عن طريق Saeman التحلل بإضافة H 2 SO 4. ثم يعاير السليلوز البلورية باستخدام طريقة anthrone اللونية 29. للتحقق إذا تم تغيير محتويات هيميسيلولوز، وتحلل مقتطفات من أحادي السكاريد سيقان المضروب باستخدام حمض trifluoroacetic، derivatized باستخدام طريقة خلات alditol ومن ثم تحليلها من قبل اللوني الغاز (GC) 30. الإجراءات التفصيلية لسل البلوريةموصوفة التحليلات تكوين المحتويات lulose والسكريات في مصفوفة فوستر وآخرون (2010) 31.
هنا، نحن تصف الإجراءات المستخدمة لاللجنين أسفل التنظيم في الذرة عن طريق التكنولوجيا رني، الجسيمات تحول القصف، وتحليل اللجنين لتسريع تفكيك الذرة الكتلة الحيوية إلى سكريات قابلة للتخمر اللجنوسليلوزية على الوقود الحيوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
إمكانية الوصول إلى السليلوزات الميكروبية لزرع السكريات جدار الخلية يعتمد إلى حد كبير على الدرجة التي ترتبط بها مع البوليمرات الفينولية 23. معدل التحويل من الكتلة الحيوية للتخمر السكر اللجنوسليلوزية يرتبط سلبا مع محتوى اللجنين المودعة في جدران الخلايا النباتي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجري التصوير المجهري عبر خدمات مركز جامعة ولاية ميشيغان للمتقدم المجهر. تم شراء الذرة الكالس من مركز تحويل الذرة من جامعة ولاية أيوا. فإن الكتاب أود أن أشكر جيفري R. يذرهيد من مختبر أبحاث جامعة ولاية ميشيغان النباتية للحصول على المساعدة الفنية له على تحليل الكربوهيدرات. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل برنامج بسخاء الذرة التسويق ميشيغان (CMPM) واتحاد لأبحاث التكنولوجيا الحيوية النباتية (CPBR).
Materials
| Media | Chemical compositions | ||
| N6OSM | 4 g/l N6 salts | ||
| (Osmotic medium) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6E | 4 g/l N6 salts | ||
| (Callus induction) | 1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 2.76 g/l proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/l casein hydrolysate | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8. | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6S media | 4 g/l N6 salts | ||
| (Selection media) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| Regeneration medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L (1000X) MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 60 g/L sucrose | |||
| 3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates) | |||
| Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving. | |||
| Rooting medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates). | |||
| Specific materials | |||
| Screw-top high pressure tubes | Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ | ||
| Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ | |||
| 10% Neutral buffered formalin | 100ml of formalin | ||
| (1 liter) | 900ml of ddH2O | ||
| 4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate | |||
| (NaH2PO4.H2O) | |||
| Equipments | |||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States) | |||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) | |||
| Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States). | |||
| HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States) | |||
| Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States) | |||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England) | |||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) | |||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | |||
| MA35 Moisture Analyzer; Sartorius | |||
| Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States) |
Riferimenti
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses – Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -. H. . Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction–poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -. H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -. H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
