Lignin nedregulering af<em> Zea mays</em> Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

Summary

En dobbeltstrenget RNA-interferens (dsRNAi) teknik anvendes til at nedregulere majs cinnamoyl coenzym A reduktase (ZmCCR1) genet til lavere plante lignin-indhold. Lignin nedregulering fra cellevæggen visualiseres ved mikroskopiske analyser og kvantificeres ved Klason metoden. Sammensætningsmæssige ændringer i hemicellulose og krystallinsk cellulose analyseres.

Abstract

For at lette anvendelsen af ​​lignocelluloseholdige biomasse som et alternativ bioenergiressource under biologiske omdannelsesprocesser, er der behov for et forbehandlingstrin til at åbne strukturen af ​​plantecellevægge, øge tilgængeligheden af ​​cellevæggen kulhydrater. Lignin, en polyphenolisk materiale til stede i mange cellevæg typer, er kendt for at være en væsentlig hindring for enzym adgang. Reduktion i lignin-indhold til et niveau, der ikke interfererer med den strukturelle integritet og forsvar af anlægget kan være et værdifuldt skridt til at reducere omkostningerne til bioethanol. I denne undersøgelse har vi genetisk nedreguleret en af lignin-biosyntese-gener, cinnamoyl-CoA-reduktase (ZmCCR1) via en dobbeltstrenget RNA-teknik interferens. Den ZmCCR1_RNAi konstruktionen blev integreret i majs genomet ved hjælp af partikel-bombardement metoden. Transgene majsplanter voksede normalt i forhold til planterne kontrol vildtype uden iterfering med vækst biomasse eller forsvarsmekanismer, med undtagelse af visning af brun-farvning i transgene planter blad midten ribben, avner og stilke. De mikroskopiske analyser, sammenholdt med den histologiske analyse, viste, at de blad sclerenchyma fibrene blev fortyndet men strukturen og størrelsen af ​​andre vigtige vaskulære systemkomponenter blev ikke ændret. Ligninindholdet i transgen majs blev reduceret med 7-8,7%, blev indholdet af krystallinsk cellulose øges som reaktion på lignin reduktion og hemicelluloser forblev uændret. Analyserne kan indikere, at kulstof flow kunne have været flyttet fra lignin biosyntese til cellulose biosyntese. Denne artikel afgrænser de procedurer, der anvendes til at nedregulere lignin indhold i majs via RNAi teknologi og cellevæggen kompositoriske analyser bruges til at kontrollere effekten af ​​ændringerne på cellens væg struktur.

Introduction

Produktionen af biobrændstoffer fra lignocellulose biomasse er meget ønskeligt på grund af sin nuværende overflod i USA ^1, og i tilfælde af en bæredygtig høst af restprodukter fra landbrug og skovbrug, evnen til ikke at konkurrere direkte om dyrkede arealer, der anvendes til produktion af foder mad og dyr. Men i modsætning til majs korn, som er den vigtigste kilde til biobrændstof i øjeblikket genereres i USA, er lignocellulosematerialer betydeligt mere kompleks og vanskelig at bryde ned. Ud over de langkædede kulhydrater, cellulose og hemicellulose, som er de vigtigste kilder til sukkerarter ved fermentering af lignocellulosematerialer, mange typer af plantecellevægge også indeholder lignin, en phenylpropanoid polymer, som giver styrke, forsvar mod patogen angreb, og hydrofobicitet til celle vægge. Mens der er nødvendige for planternes vækst og overlevelse, lignin præsenterer også en væsentlig barriere for en vellykket enzymatisk omdannelse af cellulose og hemicellutabe til opløselige sukkerstoffer. Materialer med høj lignin indhold er generelt mindre ønskværdige materialer til både biobrændstof (gennem biologisk konvertering veje) og papirmasse-og papirindustrien på grund af de negative indvirkninger på forarbejdning egenskaber og produktkvalitet. Derfor kan genetisk manipulation af plantematerialer for lignin reduktion på et niveau, der ikke interfererer med afgrøde strukturel styrke og forsvarssystemer være vigtig for nedbringelse af produktionsomkostningerne for både lignocellulose biobrændstof og papirmasse-og papirindustrien.

I majs (Zea mays), lignin er kovalent krydsbundet til hemicellulose i den primære cellevæg via ferulate og diferulate broer ^2. Lignin-hemicellulose kompleks binder til cellulosemikrofibrillerne via hydrogenbindinger til dannelse af en kompleks matrix, som giver integritet og styrke til den sekundære cellevæg. Den mekaniske styrke af plantecellevægge bestemmes i høj grad af den type lignin subunits ^3-5. I tidligere undersøgelser har ændre proportionerne lignin underenheder vist nogen klar tendens på enzymatisk fordøjelighed ^6-11. Men reduktioner i lignin-indhold viser generelt en forbedring af konverteringer ^12,13 og kan være en nøgle til at øge fordøjeligheden af plantemateriale af hydrolytiske enzymer, herunder endocellulases, cellobiohydrolaser og β-glucosidaser ^14.

Gensplejsning at regulere ekspressionsniveauet af transkripter er blevet grundigt praktiseres for at forbedre afgrøde træk. Avancerede teknikker, herunder anti-sense ¹⁵ og co-undertrykkelse ^16, at muliggøre effektiv nedregulering af target gener. Komplet gen knock-out er også opnået ved hjælp af genkonstruktioner, der koder intron-splejset RNA med en hårnål struktur ^17. Desuden en dobbeltstrenget RNA-interferens (dsRNAi) teknik, dvs en kraftfuld og effektiv genekspression mediertor, der virker ved enten målretning transkript nedbrydning eller oversættelse undertrykkelse, tilvejebringer et potent middel til at inducere en bred vifte af undertrykkelse virkninger på target mRNA ^18. Gendæmpning teknikker viser flere begrænsninger. Disse teknikker ikke nøjagtigt regulere størrelsen af ​​transkription, og det kan forårsage uventede lyddæmpningsvarianter virkninger på andre homologe gener.

I denne fremgangsmåde anvendte vi partikelbombardement at bære dsRNAi konstruktionerne i majs-genomet. Til dato har en bred vifte af plantearter succes blevet transformeret ved hjælp af partikel-bombardement, Agrobacterium-medieret transformation, elektroporation, og mikroinjektion metoder. I majs genetisk transformation, er partikelbombardement metode er fordelagtig i forhold til alle de andre metoder, fordi det er den mest effektive. Partikelbombardement er ikke afhængig af bakterier, så fremgangsmåden er fri for biologiske begrænsninger såsom størrelsen af ​​genet arter af genet ellerigin eller planten genotype. Den fysiske transgen system gør DNA med høj molekylvægt og flere gener, der skal indføres i plantegenomer og i visse tilfælde ind i chloroplaster med høj transformationseffektivitet ^19. Lignin reduktion i det vaskulære system af bladet midten ribben kan visualiseres via scanning elektronmikroskopi (SEM), som er gavnlige for behandlingen af ​​topografien og sammensætningen af ​​prøver.

I majsplanter, to af cinnamoyl-CoA reduktase (ZmCCR1: X98083 og ZmCCR2: Y15069) gener blev fundet i majsgenomet ^20. Cinnamoyl-CoA reduktase katalyserer omdannelsen af ​​hydroxycinnamoyl-CoA estere i cinnamyl aldehyder. Vi valgte ZmCCR1 genet nedregulere dette enzym, fordi genet udtrykkes i alle lignifying væv. De 523 nukleotider i 3'-enden af ZmCCR1 genet, blev valgt til en dsRNAi konstruere fordi sekvenserne viste sig at væremere forskelligartet i forhold til de af ZmCCR2. Således ville dsRNAi konstruktion præcist binder kun til ZmCCR1, undgå off-target lyddæmpning ^21. En ZmCCR1_RNAi konstruktion blev splejset ind i cytoplasmatiske ekspressionssystem ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) indeholdende grønne vævsspecifik promotor, ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase oxygenase (RuBisCO).

At studere virkningerne af dsRNAi konstruere transgene planter, blev indholdet lignin kvantificeres. Klason (syre-uopløselige) lignin måling er kendt for at være mere præcis i forhold til de sure detergent lignin kvantificering som solubiliserer noget af lignin ^22. Derfor Klason lignin blev målt i transgene majsstængler. Denne procedure består af en to-trins syrehydrolyse, der konverterer polymere kulhydrater til opløselige monosaccharider ^23. Den hydrolyserede biomasse blev derefter fraktioneret i syre opløselige og uopløselige materialerAls og syre uopløselige lignin blev målt i henhold til tidligere undersøgelser ^23,24. Ideelt set bør lignin analysen indeholde ekstraktioner med vand og ethanol før hydrolysetrinnet for at opløselige materialer, som kan interferere med resultaterne fjerne, og en post-hydrolyse forbrænding af lignin remanensen tage hensyn til eventuel aske stede i remanensen. Uden disse trin, kan indholdet af prøven lignin kunstigt oppustet. Den fulde metode præsenteres her, men for vores eksperimenter, vi var ude af stand til at udføre begge disse trin på grund af den lille mængde materiale til rådighed for testning

To andre cellevægskomponenter, cellulose og hemicellulose blev også analyseret i lignin nedreguleret transgene majs. Det er blevet rapporteret, at transgene planter, som er blevet ned-reguleret i enten deres phenylalanin ammoniak-lyase (PAL) ^25, 4-coumarat: CoA-ligase (4CL) ²⁶ eller cinnamyl enlkohol dehydrogenase (CAD) ²⁷ viser en stigning i andre celle væg strukturelle komponenter. Som et første skridt i vores studier blev krystallinsk cellulose målt ved hjælp af Updegraff metode ^28. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt udviklet til bestemmelse af cellulose i et stort antal af cellulolytiske bakterier og svampe. Kort fortalt blev de formalede af majs behandlet med Updegraff reagens (eddikesyre: salpetersyre: vand) for at fjerne hemicellulose, lignin og xylosans. Den krystallinske cellulose blev fuldstændig hydrolyseret til glucose via Saeman hydrolyse ved tilsætning af H ₂ SO _4. Det krystallinske cellulose blev derefter analyseret under anvendelse af den kolorimetriske anthron metode ^29. At kontrollere, om hemicellulose indhold blev ændret, blev monosakkarid uddrag fræsede stilke hydrolyseret hjælp trifluoreddikesyre, derivatiseret ved hjælp af alditol acetat metode og derefter analyseret ved gaskromatografi (GC) ^30. De detaljerede procedurer for krystallinsk cellulose indhold og matrix polysaccharider sammensætning analyser er beskrevet i Foster et al. (2010) ^31.

Her beskriver vi de anvendte procedurer for lignin nedregulering i majs via en RNAi teknologi, partikel bombardement transformation, og lignin analyse for accelereret dekonstruktion af majs lignocellulose biomasse til forgærbare sukkerarter til biobrændstoffer.

Protocol

1.. Udarbejdelse af dsRNAi konstruktioner Brugt til nedregulering af ZmCCR1 Design genspecifikke primere, herunder nødvendige restriktionsenzymsteder for at gøre en dsRNAi konstruere til knock-out ZmCCR1 genet. To primersæt blev designet til at forstærke to fragment segmenter af ZmCCR1 cDNA:. Et 523 bp fragment fra nukleotid 748-1271, og en 285 bp fragment fra nukleotid 986-1271 The ZmCCR1 cDNA blev taget fra Arizona Genome Institute (AGI). Flere detaljer er beskrevet i…

Representative Results

Vi har påvist en reduktion i ligninindhold i majsplanter via RNAi. Den partikelbombardement transformation metode gav omkring 30% trnasformation effektivitet. Genet undertrykkelse af ZmCCR1 blev konsekvent overholdes i T0-T2 generationer. Lignin reducerede transgene voksede på samme måde vildtypeplanter majs undtagen til visning brunfarvning i blad midt ribben, skallerne, og stilken. Den histologiske analyse har vist, at de mutante linjer udviser en signifikant reduktion i cellen vægtykkelse sclerenchyma fi…

Discussion

Tilgængeligheden af mikrobielle cellulaser til plantecellevægge polysaccharider er i vid udstrækning afhængig af, i hvilken grad de er forbundet med phenolpolymerer ^23. Den omregningskurs fra lignocellulose biomasse til forgærbare sukker er negativt korreleret med ligninindhold deponeret i plante secondadry cellevægge. Denne korrelation tilskrives de fysiske egenskaber af lignin, såsom hydrofobicitet ^24, kemisk heterogenitet, og fraværet af regelmæssige hydrolyserbar intermonomeric forbind…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)