Lignin Herunterregulierung<em> Zea mays</em> Über dsRNAi und Klason Lignin Analyse

Summary

Ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik wird eingesetzt, um nach unten zu regulieren den Mais Cinnamoyl Coenzym A-Reduktase (ZmCCR1)-Gen zu niedrigeren Pflanzen Ligningehalt. Lignin Down-Regulation aus der Zellwand wird durch mikroskopische Analysen visualisiert und durch die Klason Verfahren quantifiziert. Änderungen der Zusammensetzung in kristalliner Cellulose und Hemicellulose werden analysiert.

Abstract

Um die Verwendung von Lignocellulose-Biomasse als Alternative Bioenergie Ressource, bei der biologischen Umsetzungsprozesse zu erleichtern, ist eine Vorbehandlung erforderlich Schritt zu öffnen, die Struktur der Pflanzenzellwand, die Erhöhung der Zugänglichkeit der Zellwand Kohlenhydraten. Lignin, ein Polyphenol Material in vielen Zelltypen vorhanden Wand, ist bekannt, dass eine erhebliche Behinderung der Zugang Enzym sein. Reduzierung der Ligningehalt auf ein Niveau, das nicht mit der strukturellen Integrität und Verteidigungssystem der Anlage nicht stört könnte ein wertvoller Schritt, um die Kosten der Bioethanolproduktion zu reduzieren. In dieser Studie haben wir genetisch herunterreguliert einem der Lignin-Biosynthese-Genen, Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1) über ein Doppelstrang-RNA-Interferenztechnik. Die ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde mit der Partikelbeschuss Verfahren in die Maisgenom integriert. Transgene Maispflanzen wuchsen in der Regel im Vergleich zu den Kontrollpflanzen Wildtyp ohne interfering mit Biomasse Wachstum oder Abwehrmechanismen, mit Ausnahme der Anzeige der Braunfärbung in transgenen Pflanzen Blattmittelrippen, Hülsen, und Stängel. Die mikroskopische Analysen in Verbindung mit der histologischen Test ergab, dass die Blatt Sklerenchymfasern wurden verdünnt, aber die Struktur und Größe der anderen Hauptgefäßsystemkomponenten nicht verändert wurde. Der Ligningehalt in der transgenen Mais wurde von 7-8,7% verringert wurde das kristalline Cellulosegehalt in Reaktion auf Lignin Reduktion erhöht und Hemicellulosen unverändert. Die Analysen können zeigen, dass der Kohlenstofffluss kann von Lignin-Biosynthese Cellulose-Biosynthese verschoben wurden. Dieser Artikel umreißt die zur Herunterregulierung der Ligningehalt in Mais via RNAi-Technik Verfahren und die Zellwandzusammensetzungsanalyse verwendet, um die Wirkung der Modifikationen auf der Zellwandstruktur zu überprüfen.

Introduction

Die Produktion von Biokraftstoffen aus Lignocellulose-Biomasse ist aufgrund seiner Fülle gegenwärtig in den USA ^ein sehr wünschenswert, und im Fall der nachhaltigen Ernte von land-und forstwirtschaftlichen Rest, die Fähigkeit, nicht direkt konkurrieren um Ackerflächen für Lebensmittel-und Futtermittelproduktion verwendet. Doch im Gegensatz zu Mais Getreide, das die Hauptquelle der derzeit in den USA erzeugt Biokraftstoff ist, sind Lignocellulose-Materialien deutlich komplexer und schwieriger zu brechen. Zusätzlich zu dem langkettigen Kohlenhydrate, Cellulose und Hemicellulose, die während der Fermentation von Lignocellulose-Materialien sind die Hauptquellen für Zucker sind, viele Arten von Pflanzenzellwänden Lignin enthalten, ein Polymer, das Phenylpropanoid Stärke, Abwehr gegen Pathogenbefall bietet, und Hydrophobie an der Wand der Zelle. Während für das Pflanzenwachstum und Überleben notwendig, Lignin stellt auch ein ernsthaftes Hindernis für die erfolgreiche enzymatische Umwandlung von Cellulose und hemicelluverlieren, um lösliche Zucker. Materialien mit hoher Lignin Inhalte sind in der Regel weniger wünschenswert Materialien sowohl für die Biokraftstoff (durch biologische Umwandlung Wege) und der Zellstoff-und Papierindustrie aufgrund der negativen Auswirkungen auf die Verarbeitungseigenschaften und Produktqualität. Daher könnte die genetische Manipulation von Pflanzenmaterialien für Lignin Reduzierung auf einem Niveau, das nicht mit Pflanzen strukturelle Stärke und Verteidigungssysteme nicht beeinträchtigt wichtig für die Senkung der Produktionskosten sowohl für die Lignocellulose Biokraftstoff und der Zellstoff-und Papier-Industrie werden.

In Mais (Zea mays), Lignin kovalent vernetzt, um in der primären Zellwand und über ferulate Diferulat Brücken ² Hemicellulose. Das Lignin-Hemicellulose Komplex bindet an Cellulosemikrofibrillen über Wasserstoffbrücken bilden eine komplexe Matrix, die Integrität und Stärke verleiht dem sekundären Zellwand. Die mechanische Festigkeit von Pflanzenzellwänden wird weitgehend durch die Art bestimmt lignin Untereinheiten ^3-5. In früheren Studien, Veränderung der Anteile von Lignin-Untereinheiten hat keinen klaren Trend auf enzymatische Verdaulichkeit ^6-11 gezeigt. Allerdings Senkungen in Ligningehalt zeigen in der Regel eine Verbesserung der Conversions ^12,13 und kann ein Schlüssel zur Steigerung der Verdaulichkeit von Pflanzenmaterial durch hydrolytische Enzyme, einschließlich Endocellulasen, Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen ¹⁴ sein.

Gentechnik, um die Expression von Transkripten zu regulieren wurde ausgiebig geübt, um Pflanzenmerkmale zu verbessern. Erweiterte Techniken, einschließlich ^{Anti-Sense-15} und Co-Suppression ¹⁶ Technologien, ermöglichen eine effektive Down-Regulation von Zielgenen. Komplette Gen Knock-Out wurde auch mit Gen-Konstrukte Intron-RNA gespleißt Codierung mit einer Haarnadelstruktur ¹⁷ erreicht. Weiterhin ist ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik, dh ein leistungsfähiges und effektives Gen-Expression Mediator, die entweder gezielt Transkript Abbau oder Übersetzung Repression funktioniert, stellt ein starkes Mittel, um eine breite Palette von Unterdrückung Auswirkungen auf die Ziel-mRNA ¹⁸ induzieren. Gen-Silencing-Techniken zeigen mehrere Einschränkungen. Diese Techniken nicht genau regeln die Ebene der Transkription und es kann zu unerwarteten Silencing Auswirkungen auf andere homologe Gene verursachen.

In diesem Verfahren beschäftigten wir Partikelbeschuss zu tragen dsRNAi die Konstrukte in das Maisgenom. Bis heute eine Vielzahl von Pflanzenarten wurden erfolgreich mit Partikelbeschuss, Agrobacterium vermittelte Transformation, Elektroporation und Mikroinjektion Verfahren transformiert. In Mais genetische Transformation ist die particle bombardment Methode gegenüber allen anderen Methoden vorteilhaft, weil es die effizienteste. Partikelbeschuss ist nicht abhängig von Bakterien, so daß das Verfahren frei von biologischen Einschränkungen wie der Größe des Gens oder Gen-Artenigin oder die Pflanze Genotyp. Die physikalische Transgen Abgabesystem ermöglicht hochmolekularen DNA und mehreren Genen in Pflanzengenomen und in bestimmten Fällen in Chloroplasten mit hoher Transformationseffizienz ¹⁹ eingeführt werden. Das Lignin Verringerung des Gefäßsystems der Blattmittelrippe über Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dargestellt werden, die nützlich für die Untersuchung der Topographie und der Zusammensetzung der Proben ist.

In Maispflanzen, zwei der Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1: X98083 und ZmCCR2: Y15069)-Gene wurden in das Maisgenom ²⁰ gefunden. Cinnamoyl-CoA-Reduktase katalysiert die Umwandlung der Hydroxycinnamoyl-CoA-Ester in Cinnamyl Aldehyden. Wir wählten die ZmCCR1 Gens herunterregulieren, weil dieses Enzym das Gen in allen Geweben exprimiert verholzenden. Die 523 Nukleotide am 3'-Terminus des Gens wurden ZmCCR1 für eine dsRNAi Konstrukt gewählt, weil die Sequenzen zu sein schienvielfältiger als im Vergleich zu denen von ZmCCR2. So würde das Konstrukt genau dsRNAi nur ZmCCR1 binden, Vermeidung von ^{Off-Target-Silencing-21.} Ein ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde in der zytoplasmatischen Expressionssystems ImpactVector1.1-Tag konstruiert (IV 1,1), enthaltend das grüne Gewebe spezifischen Promotor, Ribulose-1 ,5-bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase (RuBisCO).

Um die Auswirkungen der dsRNAi bauen auf transgene Pflanzen zu untersuchen, wurde das Lignin-Gehalt quantifiziert. Die Klason (säureunlösliche) Lignin Messung ist bekannt, genauer im Vergleich zu der sauren Detergens-Lignin Quantifizierungsverfahren, die ein Teil des Lignins ²² zu lösen. Daher wurde die Klason Lignin in transgenen Maisstengel gemessen. Dieses Verfahren besteht aus zwei Schritten, die saure Hydrolyse in lösliche polymere Kohlenhydrate Monosaccharide ²³ umwandelt. Das hydrolysierte Biomasse wurde dann in Säure löslichen und unlöslichen Materialien fraktioniertALS und die Säure unlösliche Lignin wurde nach früheren Studien ^23,24 gemessen. Idealerweise sollte Lignin Analyse Extraktionen mit Wasser und Ethanol vor der Hydrolyse, um lösliche Materialien, die mit dem Ergebnis stören können, und eine post-Hydrolyse Verbrennung des Lignin-Rest, für jede in dem Rückstand enthalten Asche ausmachen. Ohne diese Maßnahmen konnte die Lignin-Gehalt der Probe künstlich aufgebläht werden. Der vollständige Verfahren wird hier dargestellt, aber für unsere Versuche waren wir nicht in der Lage, diese beiden Schritte aufgrund der geringen Materialvolumens zum Testen durch

Zwei weitere Zellwandbestandteile, Cellulose und Hemicellulose wurden auch in der Lignin herunterreguliert transgenen Maislinien analysiert. Es wurde berichtet, dass transgene Pflanzen, die entweder in ihrer Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) ^25, 4-Coumarat herunterreguliert sind: CoA-Ligase (4CL) ^26, ein oder Zimtalkohollcohol-Dehydrogenase (CAD) ²⁷ zeigen einen Anstieg in anderen Zellwandstrukturkomponenten. Als ersten Schritt in unseren Studien wurde kristalline Cellulose nach dem Verfahren Updegraff ²⁸ gemessen. Diese Methode wurde ursprünglich zur Bestimmung von Cellulose in einer großen Anzahl von cellulolytischen Bakterien und Pilze entwickelt. Kurz gesagt, wurden die gemahlenen Mais Aktien mit Updegraff Reagenz (: Salpetersäure: Essigsäure Wasser) behandelt, um Hemicellulose, Lignin und xylosans entfernen. Die kristalline Cellulose wurde vollständig durch Zugabe von H ₂ SO ₄ in Glucose über Saeman hydrolysiert. Die kristalline Cellulose wurde dann unter Verwendung der farbmetrischen Verfahren Anthron ²⁹ untersucht. Um zu überprüfen, ob die Hemicellulose Inhalt geändert wurden, wurden die Extrakte aus Monosaccharid gemahlen Stiele mit Trifluoressigsäure hydrolysiert, derivatisiert mit dem Alditolacetat Verfahren und durch Gaschromatographie (GC) ³⁰ analysiert dann. Die detaillierten Verfahren für kristalline celCellulose und den Matrixzusammensetzung Polysaccharide Analysen sind in Foster et al. (2010) ^31.

Hier beschreiben wir die für Lignin verwendeten Verfahren Herunterregulierung in Mais über eine RNAi-Technologie, Partikelbeschuss Transformation und Lignin-Analyse für beschleunigte Dekonstruktion von Mais Lignocellulose in vergärbaren Zucker für Biokraftstoffe.

Protocol

1. Vorbereitung der dsRNAi Konstrukte Wird für die Herunterregulierung von ZmCCR1 Design-Gen-spezifischen Primer einschließlich der erforderlichen Restriktionsenzym für die Herstellung einer dsRNAi Konstrukt zur Knock-out die ZmCCR1 Gen. Zwei Primer-Sets wurden entwickelt, um zwei Segmente Fragment ZmCCR1 cDNA verstärken:. Ein 523 bp-Fragment von Nukleotid 748 bis 1271 und ein 285 bp-Fragment von Nukleotid 986-1271 ZmCCR1 Die cDNA wurde von der Arizona Genome Institute …

Representative Results

Wir haben eine Verringerung der Ligningehalt in Maispflanzen durch RNAi gezeigt. Die Partikelbeschuss-Transformationsverfahren ergab rund 30% trnasformation Effizienz. Die Gen-Silencing von ZmCCR1 wurde konsequent in T0-T2 Generationen beobachtet. Die Lignin reduziert transgenics wuchs ähnlich wie Wildtyp-Mais-Pflanzen, außer für die Anzeige von Braunfärbung in der Blattmittelrippe, Schale und Schaft. Die histologischen Test hat gezeigt, dass die Mutantenlinien zeigen eine signifikante Reduktion der Zellwan…

Discussion

Die Zugänglichkeit mikrobieller Cellulasen Zellwandpolysacchariden Anlage ist weitgehend abhängig von dem Grad, in dem sie mit phenolischen Polymeren ²³ verbunden. Die Umwandlungsrate aus Lignocellulose vergärbaren Zucker ist negativ mit Lignin-Gehalt in der Pflanzenzellwänden abgelagert secondadry korreliert. Dieser Zusammenhang wird auf die physikalischen Eigenschaften von Lignin, wie Hydrophobizität ^24. chemischen Heterogenität zugeschrieben, und das Fehlen von regelmäßigen hydrolysierba…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)