Denne protokol beskriver opsætningen af en lys plade mikroskop og dens gennemførelse til in vivo billeddannelse af C. elegans embryoner.
Hurtig og lav fototoksiske billeddiagnostiske teknikker er forudsætning for at studere udviklingen af organismer i toto. Light plade baseret mikroskopi reducerer fotoblegende og fototoksisk effekt i forhold til konfokal mikroskopi, men samtidig give 3D-billeder med subcellulær opløsning. Her præsenterer vi opsætning af en plade lys baseret mikroskop, der består af en opretstående mikroskop og et lille sæt af opto-mekaniske elementer til generering af lyspladen. Protokollen beskriver, hvordan man opbygger, justere mikroskopet og karakterisere lys ark. Desuden er det i detaljer, hvordan man gennemfører metoden til in toto billeddannelse af C. elegans embryoner ved hjælp af en simpel observation kammer. Metoden gør det muligt at fange 3D to farver time-lapse film over par timers udvikling. Dette skulle lette sporing af cellens form, celledelinger og mærkede proteiner over lange perioder.
Dannelsen og formning af en organisme involverer celle bevægelser, celle form ændringer, celledeling og celledifferentiering. Forståelse af progression og koordinering af disse processer kræver hurtige billedbehandling værktøjer med tre dimensioner kapacitet og subcellulær opløsning. Blandt de teknikker med disse in vivo billeddannelse kapaciteter, også let plade belysning mikroskopi kaldet enkelt / selektiv plane illumination mikroskopi har den unikke fordel at producere lav-fototoksisk effekter og lav-fotoblegning 1,2.
I ark belysning mikroskopi prøven belyses fra siden af en let plade, som udfører den optiske sektionering. Belysningen sti og detekteringsbanen er vinkelrette på hinanden og lyspladen er justeret til at falde sammen med det formål brændplan påvisning objektivlinsen. Prøven er placeret ved krydset mellem de to veje, ennd kan bevæges langs påvisning aksen for at muliggøre 3D-billedbehandling. Kun planet af interesse belyst og alle punkter i dette plan detekteres samtidigt. Dette øger betydeligt købet hastighed og reducerer fotoblegning samt fototoksicitet i forhold til konfokal mikroskopi 3.
Praktisk, ark belysning mikroskopi er let at installere og align: for to dimensionelle billeder, er nødvendig hverken til påvisning del, heller ikke til belysning varenr scanning; som et bredt felt teknik med sektionering kapacitet, kan tre-dimensionelle billeder opnås ved en enkelt akse bevægelse af scenen holder prøven.
Her præsenterer vi oprettelsen af en simpel plade lys mikroskop og dens gennemførelse i toto billeddannelse af C. elegans embryoner. C. elegans embryoner er velegnede til at leve i vivo imaging på grund af deres gennemsigtighed, invariant afstamning og stereotype celle positioner 4,5. Den udviklede lys setup ark er baseret på en standard opretstående mikroskop til detektering. Protokollen præsenteret nedenfor detaljer, hvordan man opbygger og tilpasse excitation modul / vej, test og karakterisere lys plader og montere prøven til 3D-billedbehandling. Det giver også eksempler på time-lapse film erhverves med opsætningen på forskellige stammer, der udtrykker fluorescerende markører.
Denne protokol beskriver en nem opsætning af lys plade mikroskopi til in vivo billeddannelse af C. elegans embryoner. De optiske elementer, der er nødvendige for at skabe og tilpasse lyset ark, herunder lasere, stråle expander, kollimation og fokusere linser, kan nemt monteres på en optisk bænk. I kombination med en opretstående mikroskop til påvisning sti og kameraet, giver det en enkel løsning at sætte en plade lys mikroskop.
Denne geometri gør prøven miljø enkel. Den levende Prøven anbringes i en glaskuvette, som holdes, placeret og bevæges af et lille sæt af mekaniske dele. Da ark belysning mikroskopi er et bredt felt teknik med sektionering kapacitet, er det kun en enkelt akse motoriseret bevægelse kræves til 3D-billedbehandling. Dette begrænser kravet om synkronisering til en enkelt scanning element og letter softwareudvikling. Sammenlignet med ISPIM 6 vores opretstående geometriskRy tillader brug af høj NA objektiv til detektion. Sammenlignet med spim opsætninger med objektive linser i det vandrette plan montering af prøven og billedbehandling af en serie af embryoner er lettere. Sammenlagt gennemførelsen af denne teknik er ligetil og kan opnås med lidt ekspertise i optik. Dette er et billigere alternativ til konfokale mikroskoper med fordelene ved en højere hastighed og reduceret fototoksicitet men ulempe ved en lavere aksial opløsning.
Vi har også udviklet en nem og reproducerbar måde at montere C. elegans embryoner til in vivo billeddannelse ved hjælp af dette system. Monteringen er hurtig (15 min) og er velegnet til dagligdags eksperimenter. For C. elegans billeddannelse, fordelene ved denne simple setup er mindst to folder: (i) in toto billeddannelse er mulig uden rotation og dermed 3D rekonstruktion er ligetil; (Ii) prøve montering er enkelt og flere embryoner kan sekventielt afbildespå samme dias. Vi viste eksempler på time-lapse film med tilstrækkelig tidsopløsning at observere celledelinger og celle form ændringer. Effekten af lys plade mikroskopi at studere C. elegans udvikling er også for nylig blevet vist af andre 6, 7, 8. Derfor vil denne teknik være meget nyttigt at undersøge morfogenese og mønstret af C. elegans foster.
Kan dette system også bruges til at analysere udviklingen af andre modelorganismer? Det er vigtigt at erkende, at gennemførelsen af arket belysning mikroskopi for små og gennemsigtig organisme såsom C. elegans er lempeligere end for større organismer såsom Drosophila embryoner. I toto billeddannelse af Drosophila normalt kræver rotation og multi-view rekonstruktioner 9, 10. Ekscitation fra to sider med kolineære excitation objektive objektiver kan også reduceret skyggevirkninger forårsaget af attenuation af lys 11. Alligevel er opsætningen præsenteres her stadig tilpasset billede ene side af Drosophila embryoner med lav blegning og lav photoxicity. Denne opsætning kan også være nyttigt at billedet små og gennemsigtige embryoner såsom søpunge eller zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle de medlemmer af Lenne og Bertrand laboratorier, især Olivier Blanc for softwareudvikling og Jérémie Capoulade til diskussion. Vi takker også PICsL-IBDM imaging facilitet, især Claude Moretti og Brice Detailleur for teknisk support.
Dette arbejde blev støttet af ATIP tilskud fra CNRS (til P.-FL og VB), det LABEX INFORM tilskud (til P.-FL og VB) og en bevilling fra Sanofi-Aventis (til VB). Vi anerkender France-bioimaging infrastruktur støttes af Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, kalder "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |