Detta protokoll beskriver installationen av en ljus ark mikroskop och dess genomförande för in vivo avbildning av C. elegans embryon.
Snabba och låga fototoxiska avbildningstekniker är förutsättning för att studera utvecklingen av organismer i sin helhet. Ljus ark baserade mikroskopi minskar fotoblekning och fototoxiska effekter jämfört med konfokalmikroskopi, samtidigt som 3D-bilder med subcellulär upplösning. Här presenterar vi över konfigurationen av en ljus ark baserat mikroskop, som består av en upprättstående mikroskop och en liten uppsättning av opto-mekaniska element för alstring av ljusarket. Protokollet beskriver hur man bygger, rikta mikroskopet och karakterisera ljus arket. Vidare detaljer det hur man skall genomföra metoden i sin helhet avbildning av C. elegans embryon med hjälp av en enkel observation kammare. Metoden gör det möjligt att fånga 3D två färger time-lapse filmer under några timmar av utveckling. Detta bör underlätta spårning av cellform, celldelningar och märkta proteiner under långa tidsperioder.
Bildningen och formning av en organism involverar cellrörelser, cellformförändringar, celldelning och celldifferentiering. Att förstå utvecklingen och samordningen av dessa processer kräver snabba bildframställning med tre dimensioner kapacitet och subcellulär upplösning. Bland de tekniker med dessa in vivo bildfunktioner, ljus blad belysning mikroskopi kallas även singel / selektiv plan belysning mikroskopi har den unika fördelen att producera låg-fototoxisk effekt och låg-fotoblekning 1,2.
I ark belysning mikroskopi provet belyses från sidan med en lätt blad, som utför den optiska sektionering. Belysningen bana och detekteringsbanan är vinkelräta mot varandra och ljuset arket är inriktad att sammanfalla med det objekt fokalplan detekteringen objektivlins. Provet placeras i skärningspunkten mellan de två vägar, ennd kan förflyttas längs detekteringsaxeln för att medge 3D-avbildning. Endast planet för intresse är upplyst och alla punkter av detta plan detekteras samtidigt. Detta ökar avsevärt förvärvshastighet och minskar fotoblekning och fototoxicitet jämfört med konfokalmikroskopi 3.
Praktiskt, är blad belysning mikroskopi lätt att installera och align: för två dimensionell avbildning, är nödvändigt vare sig för den delen detektering, och inte heller för belysning delen ingen scanning; som ett brett fält teknik med sektione kapacitet, kan tre-dimensionell avbildning erhållas genom en enda axelrörelse av scenen som håller provet.
Här presenterar vi inrättandet av en enkel ljus ark mikroskop och dess genomförande i sin helhet avbildning av C. elegans embryon. C. elegans embryon är väl lämpade att leva i vivo imaging på grund av sin öppenhet, invariant härstamning och stereotypa cell placerar 4,5. Den utvecklade ljusinställningsblad är baserat på en standard upprätt mikroskop för att upptäcka. Protokollet presenteras nedan beskriver hur man bygger och rikta exciteringsmodulen / sökväg, provning och karakterisera ljus plåt och montera provet för 3D-avbildning. Det ger också exempel på tidsförlopp filmer som förvärvats med installationen på olika stammar som uttrycker fluorescerande markörer.
Detta protokoll beskriver en enkel installation av ljus plåt mikroskop för in vivo avbildning av C. elegans embryon. De optiska element som är nödvändiga för att skapa och rikta ljuset ark, inklusive laser, beam expander, kollimering och fokuseringslinser, kan enkelt monteras på en optisk bänk. I kombination med en upprätt mikroskop för sökvägen detektering och kameran, ger detta en enkel lösning för att installera en ljus ark mikroskop.
Denna geometri gör provmiljön enkel. Den levande prov placeras i en glaskuvett, som hålls och placerade och förflyttas av en liten uppsättning av mekaniska delar. Som ark belysning mikroskopi är ett brett fält teknik med sektioneförmåga, är bara en enda axel motoriserad rörelse som krävs för 3D-avbildning. Detta begränsar kravet på synkronisering till en enda svepelement och underlättar utveckling av mjukvara. Jämfört med ISPIM 6 vår upprätt GEOMETry tillåter användning av höga NA objektivlins för detektion. Jämfört med SPIM uppställningar med objektivlinser i horisontalplanet monteringen av provet och avbildning av en serie av embryon är lättare. Sammantaget är genomförandet av denna teknik enkelt och kan uppnås med lite expertis inom optik. Detta är ett billigare alternativ till konfokala mikroskop med fördelarna med en högre hastighet och minskad fototoxicitet, men nackdelen av en lägre axiell upplösning.
Vi utvecklade också ett enkelt och reproducerbart sätt att montera C. elegans embryon för in vivo imaging med detta system. Monteringsförfarandet är snabb (15 min) och är lämplig för vardagliga experiment. För C. elegans bildbehandling, fördelarna med denna enkla inställning är minst två veck: (i) i sin helhet avbildning är möjlig utan rotation och därmed 3D rekonstruktion är enkel; (Ii) prov montering är enkel och flera embryon kan sekventiellt avbildaspå samma glas. Vi visade exempel på time-lapse filmer med tillräcklig tidsupplösning för att observera celldelningar och cellformförändringar. Kraften i ljus ark mikroskop för att studera C. elegans utveckling har också nyligen illustrerats av andra 6, 7, 8. Därför kommer denna teknik att vara mycket användbart för att studera morfogenes och mönstring av C. elegans embryo.
Kan det här systemet även användas för att analysera utvecklingen av andra modellorganismer? Det är viktigt att inse att genomförandet av plåt belysning mikroskopi för små och genomskinliga organism, t.ex. C. elegans är mindre stränga än för större organismer såsom Drosophila embryon. I Toto avbildning av Drosophila kräver normalt rotation och multi-view rekonstruktioner 9, 10. Excite från två sidor med kolinjära excitation objektiv kan också minskas skuggeffekter som orsakas av attenuation av ljus 11. Ändå är inställnings presenteras här fortfarande anpassas till bilden en sida av Drosophila embryon med låg blekning och låg photoxicity. Denna inställning kan också vara till nytta för bild små och genomskinliga embryon såsom ascidians eller zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Lenne och Bertrand labb, särskilt Olivier Blanc för mjukvaruutveckling och Jérémie Capoulade för diskussion. Vi tackar också PICsL-IBDM imaging anläggning, särskilt Claude Moretti och Brice Detailleur för teknisk support.
Detta arbete stöddes av ASPETS bidrag från CNRS (till P.-FL och VB), den Labex INFORM bidraget (till P.-FL och VB) och ett bidrag från Sanofi-Aventis (till VB). Vi erkänner France-BioImaging infrastruktur som stöds av Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, kallar "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |