تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية
Summary
منذ فترة طويلة معترف بها شبكية العين القوارض باعتبارها نافذة للوصول إلى الدماغ. في هذه الورقة التقنية التي نقدمها البروتوكول الذي يستخدم نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين لدراسة الآليات التي تؤدي إلى فشل تجديد الأوعية الدموية داخل الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابة الدماغية. ويمكن أيضا وصف النظام تسخيرها لاستكشاف استراتيجيات لتعزيز إعادة نمو الأوعية الدموية وظيفية داخل شبكية العين والجهاز العصبي المركزي.
Abstract
شبكية العين القوارض وربما كان النظام في متناول معظم الثدييات التي للتحقيق التفاعل وعائية عصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتزايد الاعتراف بأن العديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب المتعدد، وعناصر التصلب الوحشي الضموري الحالية للتسوية الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتميز أبرز أسباب العمى في السكان في سن العمل للأطفال و(اعتلال الشبكية الخداج واعتلال الشبكية السكري، على التوالي) من خلال تنكس الأوعية الدموية وفشل الفسيولوجية إعادة نمو الأوعية الدموية. الهدف من هذه الورقة التقنية هو توفير بروتوكول مفصلة لدراسة الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية في شبكية العين التجديد. طريقة يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فشل نمو الأوعية الدموية بعد الإصابة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استكشاف طرائق العلاجية المحتملة لتسريع واستعادة الضفائر الأوعية الدموية صحية. النتائج obtaineد باستخدام النهج المبين قد توفر السبل العلاجية لretinopathies الدماغية مثل مرض السكري أو أن الخداج وربما تستفيد اضطرابات الأوعية الدموية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
خلال مراحل تطوره العصبي المركزي والأعصاب والخلايا المناعية والأوعية الدموية بشكل ملحوظ إلى جانب إنشاء شبكات لضمان نضح الأنسجة كافية وتسمح نقل المعلومات الحسية 1-5. يتم التعرف على نتائج انهيار النظم الأوعية الدموية في الأنسجة الأوكسجين غير كافية والعرض الأيضي للخطر وبشكل متزايد باعتبارها مساهما هاما في التسبب في أمراض الاعصاب 6. التسرب الأوعية الدموية وتدهور وحدة وعائية عصبية في الدماغ، على سبيل المثال، يرتبط الخرف الوعائي، والآفات الوعائية من المادة البيضاء في الدماغ 7 ومرض الزهايمر مع تضيق في الشرايين والأوعية الصغيرة 8. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد اختلال وظيفة الحاجز الوعائي للمساهمة التصلب المتعدد 9 وتصلب الأنسجة العضلية الجانبية 10.
صلة مباشرة لنموذج الشبكية الموصوفة في هذا البروتوكول، والمسببة للعمىأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية 11 من 12 الخداج، وتتميز من خلال 13 مرحلة من أوائل تنكس الأوعية الدموية. الإجهاد الدماغية التي تلت ذلك على شبكية العين وعائية عصبية يتسبب في المرحلة الثانية من اتساع الأوعية الدموية المفرطة والمرضية التي من المرجح ينشأ كرد فعل التعويضية للأوكسجين بإعادة العمل وإمدادات الطاقة 14-16. استراتيجية جذابة للتغلب على الإجهاد الدماغية التي أمر أساسي لتطور المرض هو استعادة شبكات الأوعية الدموية الوظيفية بشكل خاص في المناطق الدماغية من العصبية الشبكية (الشكلين 2 و 3). تثير استجابة عائية تسيطر قد تأتي عبر وغير بديهية للحالة يكون فيها العلاجات المضادة للعائية مثل مكافحة VEGFs تعتبر العلاجات تكييفها. حتى الآن، والدليل على صحة هذا النهج هو في تصاعد مستمر. على سبيل المثال، وتعزيز "الفسيولوجية مثل" إعادة نمو الأوعية الدموية في ischemوقد تجلى retinopathies جيم بأناقة من خلال إدخال الخلايا البطانية السلائف 17، وتثبيط VEGF-مولر أعرب خلية downregulation الناجم عن عوامل أخرى عائية 18، حقن الأسلاف النخاعي 19، وتثبيط NADPH أوكسيديز يسببها موت الخلايا المبرمج 20، وزيادة الغذائية ω-3 الدهنية غير المشبعة تناول حمض 21، والمعاملة مع شظية-الكربوكسيل الطرفية من التربتوفان الحمض الريبي النووي النقال مخلقة 22، والإدارة المباشرة للVEGF أو FGF-2 لحماية الخلايا الدبقية 23. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن تحوير الكلاسيكية العظة التوجيه العصبية مثل Semaphorins أو Netrins في retinopathies الدماغية الوعائية يسرع تجديد الأوعية صحية داخل شبكية العين والأوعية الدموية يقلل المرضية 24 و 25 بالتالي. من الأهمية السريرية المباشرة، فإن العديد من الدراسات على الحيوانات المذكورة أعلاه توفر أدلة على أن تعزيز إعادة الأوعية الدمويةالجيل خلال المرحلة الأولى من retinopathies الدماغية يمكن أن تقلل إلى حد كبير التي تهدد البصر اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل 19، 23، 24، 26، من المحتمل من خلال الحد من عبء الدماغية.
وضع الاستراتيجيات العلاجية التي تحفز تجديد السفن وظيفية لا يزال يشكل تحديا كبيرا للعلماء البيولوجيا الوعائية. نحن هنا تصف نظام التجريبية التي توظف نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) لاستكشاف استراتيجيات لإعادة نمو الأوعية الدموية تعدل داخل شبكية العين. التي وضعتها سميث وآخرون في عام 1994 27، ويقدم هذا النموذج كبديل لretinopathies التكاثري الإنسان ويتكون من تعريض الجراء P7 الماوس إلى 75٪ O 2 حتى P12 ثم إعادة إدخال الجراء إلى الغرفة المحيطة O 2 التوتر (الشكل 1). هذا النموذج يحاكي سيناريو فضفاضة حيث التهوية الرضع والخدج مع O 2. تعرض الجراء الماوس لفرط التأكسج يثير تنكس الشبكية والأوعية الدموية الدقيقة الشعيرات الدموية، وتعطي المجال استنساخه من الوعاء-الطمس (VO) المقررة عادة عند الخروج من O 2 في P12، على الرغم من أن يتم التوصل منطقة VO القصوى في 48 ساعة (P9) بعد التعرض لO 2 28. في الماوس، ومناطق VO اوعائي تجديد بصورة تلقائية على مدار الأسبوع التالي لإعادة إدخال هواء الغرفة والمناطق في نهاية المطاف VO يتم الانتهاء من إعادة أوعية دموية (الشكل 2). إعادة مقدمة لهواء الغرفة من الفئران تعرض لOIR أيضا يثير اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل (NV) (القصوى في P17) أن يتم تقييم عادة لتحديد مدى فعالية العلاج المضاد للنماذج عائية. في أنقى صورها، ويقدم نموذج OIR أداة تكرار للغاية وقابلة للقياس لتقييم الأوكسجين الناجم عن تنكس الأوعية الدموية وتحديد مدى اتساع الأوعية الدموية المدمرة قبل الشبكية 29-31.
<p claق ق = "jove_content"> مختلف نماذج العلاج الاستكشافية التي تعدل الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية التجديد يمكن التحقيق باستخدام نموذج OIR بما في ذلك استخدام المركبات الدوائية، والعلاج الجيني، حذف الجينات وأكثر من ذلك. الميل لنهج معين للتأثير على إعادة نمو الأوعية الدموية ويتم تقييم تدريجي في الإطار بين P12 (VO القصوى بعد الخروج من فرط التأكسج) وP17 (NV القصوى). تقييم نتائج العلاج على NV المرضية يمكن بسرعة وبسهولة تحديد بالتوازي ولقد وصفت بدقة من قبل ستال وزملاؤه 30، 31. هنا نقدم خطوة بخطوة إجراء بسيط للتحقيق في التشكيل من عودة التوعي الفسيولوجية داخل الشبكية العصبية بواسطة مركبات الدوائية، المداواة المحتملين، ناقلات فيروسية أو لدراسة تأثير الجينات المعدلة وراثيا أو مرشح في خروج المغلوب الفئران.Protocol
Representative Results
Discussion
ما هي الطريقة الأكثر فعالية لتحفيز نمو الأوعية صحية جديدة في النسيج العصبي الدماغية؟ هل يصح علاجيا لتتداخل مع وتسريع إعادة نمو الأوعية الدموية التي تحدث بشكل طبيعي؟ في الأمراض العصبية الدماغية مثل retinopathies الدماغية أو السكتة الدماغية، ويرتبط تنكس الأوعية الدموية مع…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS حاصل على كرسي أبحاث كندا في الشبكية بيولوجيا الخلية وجائزة معهد بحوث ألكون باحث جديد. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (221478)، والجمعية الكندية للسكري (OG-3-11-3329-PS)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (418637) والعمى مؤسسة القتال كندا. وقدم الدعم أيضا من قبل RESEAU للبحوث في مجال سانتي دي لا الرؤية كيبيك.
Materials
| C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
Riferimenti
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
- Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
- Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
- Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
- Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
- Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
- Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
- Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
- Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
- Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
- Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
- Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
- Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
- Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
- Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
- Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
- Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
- Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
- Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
- Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
- Joyal, J. -. S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
- Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
- Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
- Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
- Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
- Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
- Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
- Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
- Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
- Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
- Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
- Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
