Bedömning av Vascular Regeneration i CNS Använda musen Retina

Summary

Den gnagare näthinna har länge setts som ett tillgängligt fönster till hjärnan. I denna tekniska papper ger vi ett protokoll som använder den musmodell av syre-inducerad retinopati att studera de mekanismer som leder till misslyckande av vaskulär förnyelse inom det centrala nervsystemet efter ischemisk skada. Det beskrivna systemet kan även utnyttjas för att undersöka strategier för att främja återväxt av funktionella blodkärl i retina och CNS.

Abstract

Den gnagare näthinnan är kanske den mest tillgängliga däggdjurs system där för att undersöka neurovaskulär samspelet inom det centrala nervsystemet (CNS). Det allt större utsträckning erkänt att flera neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, multipel skleros, och amyotrofisk lateralskleros presentera delar av vaskulär kompromiss. Dessutom är de mest framträdande orsakerna till blindhet hos barn och arbets åldersgrupper (retinopati hos prematura barn och diabetesretinopati, respektive) som kännetecknas av vaskulär degeneration och misslyckande fysiologiska kärl återväxt. Syftet med denna tekniska papper är att ge ett detaljerat protokoll för att studera CNS vaskulär förnyelse i näthinnan. Metoden kan användas för att belysa molekylära mekanismer som leder till misslyckande av vaskulär tillväxt efter ischemisk skada. Dessutom kan potentiella terapeutiska metoder för att påskynda och återställa sunda vaskulära plexus utforskas. Rönet obtained med den beskrivna metoden kan ge terapeutiska avenyer för ischemiska retinopatier liksom det av diabetes eller prematuritet och eventuellt dra andra vaskulära sjukdomar i CNS.

Introduction

Under hela CNS utveckling, nerver, immunceller och blodkärl etablera anmärkningsvärt kopplade nätverk för att säkerställa tillräcklig vävnadsperfusion och möjliggöra överföring av sensorisk information ^1-5. Fördelningen av kärlsystem ger otillräcklig vävnad syresättning och nedsatt metabol utbud och är alltmer som en viktig bidragsgivare till patogenesen vid neurodegenerativa sjukdomar ^6. Vaskulär dropout och försämringen av den neurovaskulära enhet inom hjärnan, till exempel, är i samband med vaskulär demens, kärlskador i den vita substansen i hjärnan ⁷ och Alzheimers sjukdom med stenos av arterioler och små kärl ^8. Dessutom är försämrad vaskulär barriärfunktion tros bidra multipel skleros ⁹ och amyotrofisk lateralskleros ^10.

Av direkt betydelse för retinal modell som beskrivs i detta protokoll, bländandesjukdomar, såsom diabetisk retinopati ¹¹ och retinopati hos prematura ^{12, 13} kännetecknas av en fas av tidig vaskulär degeneration. Den påföljande ischemisk stress på neurovaskulära näthinnan utlöser en andra fas av överdriven och patologisk kärlnybildning som troligen har sitt ursprung som en kompensatorisk reaktion på återinföra syre-och energiförsörjning ^14-16. En attraktiv strategi för att övervinna den ischemiska stress som är central för sjukdomsförloppet är att återskapa funktionella vaskulära nätverk specifikt i den ischemiska zoner i neuro-näthinnan (figur 2 och 3). Provocera en kontrollerad angiogena svar kan upplevas som krånglig för ett tillstånd där anti-angiogena behandlingar såsom anti VEGFs betraktas som anpassade behandlingar. Ändå är bevis för giltigheten av detta tillvägagångssätt montering. Till exempel, öka "fysiologisk-liknande" vaskulär återväxt i ischemic retinopatier har elegant visats genom införande av endothelial prekursorceller ^17, hämning av Müller cell uttryckt VEGF inducerad nedreglering av andra angiogena faktorer ^18, injektion av myeloida stamceller ^19, hämning av NADPH-oxidas inducerad apoptos ^20, öka kost ω-3 fleromättade fettsyror syraintaget ^21, behandling med en karboxyl-terminala fragmentet av tryptofan tRNA-syntetas ²² och direkt administrering av VEGF eller FGF-2 för skydd av gliaceller ^23. Dessutom har vi visat att modulera klassiska neuronala vägledning ledtrådar såsom semaforiner eller Netrins i ischemiska retinopatier accelererar vaskulär regeneration av friska fartyg inom näthinnan och följaktligen reducerar patologisk angiogenes ^{24, 25.} Av direkt klinisk relevans, flera av de tidigare nämnda djurstudier ger belägg för att främja kärl regeneration under den tidiga ischemiska fasen av retinopatier kan avsevärt minska syn-hotande pre-retinal kärlnybildning ^{19, 23, 24, 26,} troligen genom en minskning av ischemisk börda.

Utforma terapeutiska strategier som stimulerar förnyelse av funktionella fartyg är fortfarande en betydande utmaning för kärl biologer. Här beskriver vi ett experimentellt system som använder den musmodell av syre-inducerad retinopati (OIR) att undersöka strategier för att modulera kärl återväxt inom näthinnan. Utvecklad av Smith et al. 1994 ^27, tjänar denna modell som en proxy för mänskliga proliferativa retinopatier och består av att utsätta P7 mus valpar till 75% O ₂ tills P12 och därefter återinföra valparna till omgivande rums O _2-spänning (Figur 1). Detta paradigm härmar löst ett scenario där en tidig spädbarn ventilerasmed O _2. Exponeringen av mus valpar till hyperoxia framkallar degenerering av retinala kapillärer och mikrocirkulation, och ger en reproducerbar yta på vaso-utplåning (VO) normalt bedöms vid utträde från _O2 vid P12, även om maximal VO område nås vid 48 h (P9) efter exponering för O ₂ ^28. I musen, de avaskulära VO zonerna regenerera spontant under loppet av veckan efter återinförande till rumsluft och så småningom VO zoner är helt omar vaskulariserad (Figur 2). Återinförande till rumsluften hos möss som utsätts för OIR provocerar också pre-retinal kärlnybildning (NV) (maximal vid P17) som normalt bedöms att bestämma effekten av anti-angiogena behandling paradigm. I sin renaste form, ger OIR modellen en mycket reproducerbar och kvantifierbar verktyg för att bedöma syre-inducerad kärldegeneration och fastställa omfattningen av destruktiva pre-retinal kärlnybildning ^29-31.

<p class = "jove_content"> Olika explorativ behandlingsparadigm som modulerar CNS vaskulär förnyelse kan undersökas med hjälp av OIR modellen inklusive användning av farmakologiska föreningar, genterapi, gendeletion och mer. Benägenheten hos en given metod för att påverka kärl återväxt bedöms stegvis i fönstret mellan P12 (maximal VO efter avfarten från hyperoxia) och P17 (maximal NV). Utvärdering av behandlingsresultat på patologisk NV kan snabbt och enkelt bestämmas parallellt och är noggrant beskriven av Stahl och kollegor ^{30, 31.} Här ger vi en enkel steg-för-steg för att undersöka modulering av fysiologiska revaskularisering inom det neurala näthinnan av farmakologiska föreningar, blivande terapi, virala vektorer eller att studera inverkan av kandidatgener i transgena eller knockout-möss.

Protocol

Etik uttalande: Alla djurförsök följer de riktlinjer djurskötsel fastställts av Föreningen för forskning i Vision och Oftalmologi (ARVO) uttalande om användningen av djur i ögon och Vision Research och den kanadensiska rådet om Animal Care. 1. Syre Induced Retinopati (OIR) Avstämningsdag för födelse mus valpar som P0. Spela in alla vikter av djur vid inträdet i O 2 för att säkerställa en adekvat viktområde. Obs: För C57BL / …

Representative Results

Den OIR Modellen används ofta för att studera syre-inducerad kärldegeneration och ischemi-inducerad patologisk kärlnybildning i näthinnan och har varit avgörande för utvecklingen av närvarande används anti-angiogena behandlingar för ögonsjukdomar 27, 29, 30. Rön som erhållits med hjälp av denna modell kan löst extrapoleras till ischemiska retinopatier såsom proliferativ diabetesretinopati och retinopati hos prematura 30. Här presenterar vi en alternativ…

Discussion

Vad är det mest effektiva sättet att stimulera tillväxten av nya friska kärl i vävnader ischemisk nervös? Är det terapeutiskt giltigt att störa och accelerera naturligt förekommande kärl återväxt? I neuro-ischemiska sjukdomar såsom ischemiska retinopatier eller stroke, är vaskulär degeneration associerad med minskad neuronal funktion ^35-38. Därför att motverka tidig skada, återinföra den regionala mikrocirkulationen under den omedelbara / tidig segment av sjukdom kan vara till nytta. Vid en…

Materials

C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945