Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie
Summary
We beschrijven de dissectie en ex vivo cultuur van muis embryonale huid. De cultuur systeem houdt een lucht-vloeistof-interface over het weefsel oppervlak en maakt beeldvorming op een omgekeerde microscoop. Melanoblasten, een component van de ontwikkeling huid, worden fluorescerend gemerkte waardoor hun gedrag wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie.
Abstract
Melanoblasten zijn de neurale lijst afkomstig voorlopers van melanocyten; de cellen die verantwoordelijk zijn voor de productie van pigment in huid en haar. Melanoblasten migreren door de epidermis van het embryo waar ze vervolgens koloniseren de ontwikkelende haarzakjes 1,2. Neurale lijst cel migratie wordt uitgebreid bestudeerd in vitro maar in vivo methoden zijn nog niet goed ontwikkeld, vooral in zoogdiersystemen. Een alternatief is om ex vivo organotypische cultuur 3-6 gebruiken. Cultuur van muis embryonale huid vereist handhaving van een lucht-vloeistof-interface (ALI) over het oppervlak van het weefsel 3,6. Hoge resolutie voor live-beeldvorming van muis embryonale huid is belemmerd door het ontbreken van een goede methode die niet alleen onderhoudt deze ALI, maar maakt het ook mogelijk de cultuur te worden omgekeerd en derhalve verenigbaar met korte werkafstand objectieven en meest confocale microscopen. Dit artikel beschrijft de recente verbeteringen naar een method die gebruik maakt van een gas-permeabel membraan om deze problemen te overwinnen en een hoge-resolutie confocale beeldvorming van embryonale huid in ex vivo cultuur 6. Door het gebruik van een melanoblast specifieke Cre-recombinase uiten muis lijn gecombineerd met de R26YFPR reporter lijn kunnen we fluorescent labelen de melanoblast bevolking binnen deze huid culturen. De techniek maakt levend beeldvorming van melanoblasten en observatie van hun gedrag en interacties met het weefsel waarin ze zich ontwikkelen. Representatieve resultaten zijn opgenomen om de mogelijkheid om live-beeld 6 culturen in parallel aan te tonen.
Introduction
Traditioneel embryonale huid is gekweekt door het ontleden van de muis embryo en montage op een polycarbonaat Nuclepore membraan. Het membraan wordt vervolgens geïntroduceerd op kweekmedium zo tot een lucht-water grensvlak over het oppervlak van de ontwikkelende weefsels 3,4. Deze techniek is gebruikt om melanoblast gedrag assay door de vaststelling van het weefsel en beoordelen melanoblast verspreiden via β-galactosidase als merker 7. We hebben een methode die live beeldvorming van fluorescent gelabelde melanoblasten in ex vivo huid cultuur 6 laat ontwikkeld. Hier beschrijven we de methode in detail uit dissectie, te installeren, te confocale beeldvorming wonen en ook enkele recente verbeteringen.
Melanoblasten zijn de embryonale voorlopers van melanocyten, de cellen die pigment produceren haar en huid. Melanoblasten voordoen in de neurale naast de neurale buis op ongeveer embryonale dag 9 (E9) in de ontwikkelende muizen embryo. Vervolgens trekken ze langs een dorsolaterale pad tussen het ectoderm en het ontwikkelen van somieten. Bij E12.5 ze van de dermis naar de epidermis, waar ze groeien en hun migratie voort te zetten. De primaire haarzakje patroon begint te vormen in de epidermis op E14.5 en E15.5 melanoblasten zijn lokaliseren deze follikels. Voor een overzicht van melanoblast / melanocyten ontwikkeling zien Thomas & Erickson (2008) 1. Om melanoblast populatie label wij Tyr combined :: CREB dieren Cre-recombinase gedreven door de muis tyrosinase promotor 8 met R26YFPR dieren geel fluorescerend eiwit (YFP) voorwaardelijk uitdrukking van de ROSA26 locus 9 drukken.
We beschrijven een methode om cultuur embryonale huid en foto's maken met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Het aangepaste vorm van de oorspronkelijke werkwijze mort et al. beschreven. (2010) 6. De huidigewerkwijze maakt beeldvorming in een 6-well formaat en verwijdert de afhankelijkheid Nuclepore membranen en Matrigel de cultuur ondersteunen. In plaats daarvan gebruik van een klein blok van 1% agarose aan de embryonale huid te stabiliseren. De afhankelijkheid Matrigel verwijderen is belangrijk, vooral in situaties waarin de reactie van de embryonale huid oplosbare groeifactoren is de focus van de studie. Onze oorspronkelijke methode is al gebruikt om nieuwe inzichten in melanoblast ontwikkeling 10-13 te winnen en we verwachten dat de verbeteringen die we hier beschrijven het krachtiger zal maken als een experimentele techniek vooral wanneer meerdere parallelle culturen zijn een vereiste.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een methode om cultuur embryonale huid die bijzonderheid vatbaar is voor live-cell imaging op omgekeerde confocale microscopen. De werkwijze omvat recente verbeteringen waarmee 6 culturen te beelden parallel en verwijdert de afhankelijkheid van Matrigel en Nuclepore membranen van de oorspronkelijke methode 6. Het cruciale technische verschil met soortgelijke technieken is het gebruik van een gas-permeabel membraan lummox een lucht-water grensvlak stellen en ook om als een dekglaasje. We hebben …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door de basisfinanciering van de Medical Research Council. We zijn dankbaar voor Craig Nicol voor het bereiden van technische tekeningen. We zijn dankbaar voor Matthew Pearson en Paul Perry voor hun beeldvorming ondersteuning.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia dello sviluppo. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia dello sviluppo. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia dello sviluppo. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
