Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste
Summary
Nous décrivons la dissection et la culture ex vivo de peau embryonnaire de la souris. Le système de culture maintient une interface air-liquide sur la surface du tissu et permet une imagerie sur un microscope inversé. Mélanoblastes, une composante de la peau en développement, sont marqué par fluorescence permettant leur comportement à observer par microscopie confocale.
Abstract
Mélanoblastes sont la crête neurale précurseurs de mélanocytes dérivés; les cellules responsables de la production du pigment dans la peau et les cheveux. Mélanoblastes migrent à travers l'épiderme de l'embryon où elles colonisent ensuite le développement de follicules de cheveux de 1,2. La migration des cellules de la crête neurale est largement étudiée in vitro, mais les méthodes in vivo ne sont pas encore bien développée, surtout dans les systèmes mammifères. Une alternative est d'utiliser culture ex vivo organotypique 3-6. Culture de peau embryonnaire de la souris nécessite le maintien d'une interface air-liquide (ALI) à travers la surface du tissu de 3,6. Haute résolution live-imagerie de la peau embryonnaire de la souris a été entravée par l'absence d'une bonne méthode qui maintient non seulement ce ALI mais permet aussi la culture à être inversée et donc compatible avec courte distance de travail lentilles de l'objectif et des microscopes les plus confocale. Cet article décrit les améliorations récentes à une méthod qui utilise une membrane perméable aux gaz pour surmonter ces problèmes et de permettre à haute résolution de l'imagerie confocale peau embryonnaire en culture ex vivo 6. En utilisant un mélanoblaste Cre recombinase spécifique exprimant lignée de souris combinée avec la ligne de reporter R26YFPR nous sommes en mesure de marquer par fluorescence la population mélanoblaste dans ces cultures de la peau. Cette technique permet de live-imagerie de mélanoblastes et l'observation de leur comportement et les interactions avec le tissu dans lequel elles se développent. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer la capacité de vivre-image 6 cultures en parallèle.
Introduction
Traditionnellement peau embryonnaire a été cultivée en disséquant de l'embryon de souris et de montage sur une membrane en polycarbonate Nuclepore. La membrane est ensuite introduit sur un milieu de culture, en maintenant ainsi une interface air-liquide sur la surface du tissu en développement 3,4. Cette technique a été utilisée pour analyser le comportement mélanoblaste en fixant le tissu et l'évaluation de la distribution en utilisant mélanoblaste β-galactosidase en tant que marqueur 7. Nous avons développé une méthode qui permet mélanoblastes live-imagerie de fluorescence marqués en culture ex vivo de la peau 6. Ici, nous décrivons la méthode en détail de dissection, de configuration, de vivre l'imagerie confocale et incluons certaines améliorations récentes.
Mélanoblastes sont les précurseurs embryonnaires des mélanocytes, les cellules qui produisent le pigment dans les cheveux et la peau. Mélanoblastes se posent dans la crête neurale à côté du tube neural pendant la journée autour embryonnaire 9 (E9) chez la souris e développementmbryo. Par la suite, ils migrent le long d'une voie dorsolatéral entre l'ectoderme et les somites développement. A E12.5 ils se déplacent du derme à l'épiderme où ils prolifèrent et continuent leur migration. Le motif de follicule pileux primaire commence à se former dans l'épiderme à E14.5 et E15.5 par mélanoblastes sont à localiser ces follicules. Pour une analyse de l'évolution mélanoblaste / mélanocytes voir Thomas & Erickson (2008) 1. Afin de marquer la population mélanoblaste nous avons combiné Tyr :: CREB animaux qui expriment la Cre-recombinase dirigée par le promoteur de la tyrosinase de la souris avec 8 animaux R26YFPR qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP), conditionnellement à partir du locus ROSA26 9.
Nous décrivons un procédé de culture d'embryons images de la peau et de saisie à l'aide d'un microscope confocal inversé. Il est adapté sous forme de la méthode originale décrite dans Mort et al. (2010) 6. La présenteméthode permet l'imagerie dans un format de 6 puits et élimine le recours à des membranes Nuclepore et sur matrigel à soutenir la culture. Au lieu de cela à l'aide d'un petit bloc d'agarose à 1% pour stabiliser la peau embryonnaire. Retrait de la dépendance à l'égard matrigel est particulièrement important dans les cas où la réponse de la peau embryonnaire à des facteurs de croissance solubles est l'objet d'étude. Notre méthode originale a déjà été utilisé pour acquérir de nouvelles connaissances dans le développement de mélanoblaste 10-13 et nous prévoyons que les améliorations que nous décrivons ici, il sera plus puissant qu'une technique expérimentale en particulier lorsque plusieurs cultures parallèles sont une exigence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une méthode de culture embryonnaire peau qui est particularité prête à l'imagerie des cellules vivantes sur des microscopes confocaux inversées. Le procédé comprend les améliorations récentes qui permettent 6 cultures à imager en parallèle et supprime le recours à matrigel et membranes Nuclepore de la méthode originale 6. La différence essentielle technique de techniques similaires est l'utilisation d'une membrane perméable aux gaz lourdaud pour établir une interfac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par un financement de base du Conseil de recherches médicales. Nous sommes reconnaissants à Craig Nicol pour préparer des dessins techniques. Nous sommes reconnaissants à Matthew Pearson et Paul Perry pour leur soutien d'imagerie.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
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