Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten
Summary
Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.
Abstract
Melanoblasten sind die Neuralleiste Vorläufer von Melanozyten; die Zellen zur Herstellung des Pigments in Haut-und Haar verantwortlich. Melanoblasten wandern durch die Epidermis des Embryos, wo sie anschließend besiedeln die Entwicklungs Haarfollikel 1,2. Neuralleiste Zellmigration wird weitgehend in vitro untersucht, aber in vivo-Methoden sind immer noch nicht gut entwickelt, vor allem in Säugetiersystemen. Eine Alternative ist die ex vivo organotypischen Kultur 6.3 zu verwenden. Kultur von embryonalen Maus-Haut erfordert die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Interface (ALI) über die Oberfläche des Gewebes 3,6. Hochauflösende Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Haut hat sich durch den Mangel an einer guten Methode, die nicht nur unterhält diese ALI, sondern ermöglicht auch die Kultur umgekehrt werden und daher mit kurzen Arbeitsabstand und die meisten Objektive konfokalen Mikroskopen behindert. Dieser Artikel beschreibt die jüngsten Verbesserungen an einen Method dass verwendet eine gasdurchlässige Membran, diese Probleme zu überwinden und hochauflösenden konfokalen Imaging der embryonalen Haut in Ex-vivo-Kultur 6. Durch die Verwendung eines spezifischen Melanoblasten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie in Kombination mit der R26YFPR Reporter Linie sind wir in der Lage, innerhalb dieser Hautkulturen fluoreszenz beschriften Sie die Melanoblasten Bevölkerung. Die Technik ermöglicht Live-Bildgebung von Melanoblasten und der Beobachtung ihres Verhaltens und ihrer Wechselwirkungen mit dem Gewebe, in dem sie sich entwickeln. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um die Fähigkeit zu leben-Bild 6 Kulturen parallel zu demonstrieren.
Introduction
Traditionell embryonalen Haut durch Sezieren von der Maus Embryo und die Montage auf einem Polycarbonat Nuclepore Membran kultiviert. Die Membran wird dann auf Kulturmedium schwimmen, damit die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf der Oberfläche der Entwicklungs Gewebe 3,4. Diese Technik wurde verwendet, um Melanoblasten Verhalten durch Fixieren des Gewebes und der Beurteilung Melanoblasten Verteilung mit β-Galactosidase als Markierungs 7 testen. Wir haben eine Methode, die Live-Imaging von fluoreszenzmarkierten Melanoblasten in ex vivo Hautkultur 6 ermöglicht. Hier beschreiben wir die Methode im Detail von der Dissektion zu gründen, um die konfokale Bildgebung und umfassen einige der jüngsten Verbesserungen.
Melanoblasten sind die embryonalen Vorstufen der Melanozyten, die Zellen, die Pigment im Haar und Haut. Melanoblasten entstehen in der Neuralleiste neben dem Neuralrohr bei rund embryonalen Tag 9 (E9) in der Entwicklung von e-Mausmbryo. Anschließend wandern sie entlang einer dorsolateralen Weg zwischen Ektoderm und den Entwicklungs Somiten. Bei E12.5 sie aus der Dermis zu bewegen, um die Epidermis, wo sie sich vermehren und setzen ihre Migration. Der primäre Haarfollikel Muster beginnt in der Epidermis bei E14.5 und E15.5 durch Melanoblasten werden, um die Lokalisierung dieser Follikel zu bilden. Für einen Überblick über Melanoblasten / Melanozyten-Entwicklung zu sehen Thomas & Erickson (2008) ein. Um die Bevölkerung Melanoblasten beschriften wir Tyr kombiniert :: CREB Tiere, die Cre-Rekombinase-von der Maus Tyrosinase-Promotor mit 8 R26YFPR Tiere, die gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bedingt von der ROSA26 Locus 9 auszudrücken angetrieben auszudrücken.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut und die Aufnahmen mit einem inversen konfokalen Mikroskop. Es wird in der Form angepasst Mort et al ursprünglichen Methode. (2010) 6. Die vorliegendeVerfahren ermöglicht die Abbildung in einer 6-Well-Format und entfernt die Abhängigkeit von Nuclepore Membranen und auf Matrigel, um die Kultur zu unterstützen. Statt mit einem kleinen Block von 1% Agarose, um die embryonale Haut zu stabilisieren. Entfernen der Abhängigkeit von Matrigel ist besonders in Situationen, in denen die Reaktion der embryonalen Haut löslichen Wachstumsfaktoren im Mittelpunkt der Untersuchung wichtig. Unsere ursprüngliche Methode wurde bereits verwendet worden, um neue Einblicke in die Entwicklung Melanoblasten 10-13 zu gewinnen, und wir erwarten, dass die Verbesserungen, die wir hier beschreiben, wird es stärker als experimentelle Technik vor allem, wenn mehrere parallele Kulturen sind eine Voraussetzung zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut, die Besonderheit zugänglich Live-Cell-Imaging auf invertierten konfokalen Mikroskopen ist. Das Verfahren umfasst die jüngsten Verbesserungen, die sechs Kulturen parallel abgebildet werden und beseitigt die Abhängigkeit von Matrigel und Nuclepore Membranen der ursprünglichen Methode 6 ermöglichen. Der entscheidende technische Unterschied von ähnlichen Techniken ist die Verwendung einer gasdurchlässigen Membran lummox, eine Luftschnittstelle Flü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch die Grundfinanzierung von der Medical Research Council unterstützt. Wir sind dankbar, dass Craig Nicol für die Herstellung von technischen Zeichnungen. Wir sind dankbar, dass Matthew Pearson und Paul Perry für ihre Imaging-Unterstützung.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
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