माउस भ्रूणीय त्वचा और Melanoblast प्रवासन के रहते इमेजिंग के पूर्व vivo संस्कृति
Summary
हम माउस भ्रूण त्वचा के विच्छेदन और पूर्व vivo संस्कृति का वर्णन है. संस्कृति प्रणाली ऊतक सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस का कहना है और एक औंधा माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग की अनुमति देता है. Melanoblasts, विकासशील त्वचा के एक घटक, fluorescently उनके व्यवहार confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा जा करने की अनुमति चिह्नित कर रहे हैं.
Abstract
Melanoblasts melanocytes के व्यापारियों व्युत्पन्न तंत्रिका शिखा कर रहे हैं; त्वचा और बालों में रंगद्रव्य उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं. Melanoblasts वे बाद में विकासशील बाल 1,2 रोम उपनिवेश जहां भ्रूण की एपिडर्मिस के माध्यम से विस्थापित. तंत्रिका शिखा सेल प्रवास बड़े पैमाने पर इन विट्रो में अध्ययन किया जाता है लेकिन इन विवो तरीकों में अभी भी अच्छी तरह से विशेष रूप से स्तनधारी प्रणालियों में विकसित नहीं कर रहे हैं. एक विकल्प के पूर्व vivo organotypic संस्कृति 3-6 उपयोग करने के लिए है. माउस भ्रूण त्वचा की संस्कृति ऊतक 3,6 की सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस (अली) के रखरखाव की आवश्यकता है. माउस भ्रूण त्वचा के उच्च संकल्प रहते इमेजिंग इस अली का कहना है, लेकिन यह भी संस्कृति उल्टे और कम काम दूरी उद्देश्य लेंस और सबसे confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ इसलिए संगत होना करने की अनुमति देता है कि न केवल एक अच्छे विधि के अभाव के कारण बाधा उत्पन्न किया गया. यह लेख एक meth के लिए हाल ही में सुधार का वर्णनआयुध डिपो है कि इन समस्याओं को दूर करने और पूर्व vivo संस्कृति 6 में भ्रूण त्वचा के उच्च संकल्प confocal इमेजिंग की अनुमति के लिए एक गैस पारगम्य झिल्ली का उपयोग करता है. एक melanoblast विशिष्ट Cre पर recombinase R26YFPR संवाददाता लाइन के साथ संयुक्त माउस लाइन व्यक्त उपयोग करके हम fluorescently इन त्वचा संस्कृतियों के भीतर melanoblast आबादी लेबल में सक्षम हैं. तकनीक की अनुमति देता है melanoblasts और उनके व्यवहार और वे जो विकास में ऊतक के साथ बातचीत के अवलोकन के रहते इमेजिंग. प्रतिनिधि परिणाम क्षमता को जीने की छवि समानांतर में 6 संस्कृतियों का प्रदर्शन करने के लिए शामिल किए गए हैं.
Introduction
परंपरागत रूप से भ्रूण त्वचा माउस भ्रूण से विदारक और एक polycarbonate Nuclepore झिल्ली पर बढ़ते द्वारा संवर्धित किया गया है. झिल्ली फिर इस प्रकार के विकास ऊतक 3,4 की सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस को बनाए रखने, संस्कृति माध्यम पर जारी है. इस तकनीक ऊतक फिक्सिंग और एक मार्कर के रूप में 7 β-galactosidase का उपयोग melanoblast वितरण का आकलन करने से melanoblast व्यवहार परख करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम पूर्व vivo त्वचा संस्कृति 6 में रहते इमेजिंग के fluorescently लेबल melanoblasts अनुमति देता है एक विधि विकसित की है. यहाँ हम confocal इमेजिंग जीने के लिए, सेटअप करने के लिए, विच्छेदन से विस्तार में विधि का वर्णन है और हाल ही में कुछ सुधार शामिल हैं.
Melanoblasts melanocytes के भ्रूण व्यापारियों, बाल और त्वचा में रंगद्रव्य उत्पादन कि कोशिकाओं रहे हैं. Melanoblasts विकासशील माउस ई में भ्रूण दिन 9 (E9) के आसपास में न्यूरल ट्यूब से सटे तंत्रिका शिखा में उठताmbryo. इसके बाद वे बाह्य त्वक स्तर और विकासशील somites के बीच एक dorsolateral मार्ग के साथ विस्थापित. E12.5 में वे पैदा करना और उनके प्रवास के लिए जारी जहां एपिडर्मिस को डर्मिस से चलते हैं. प्राथमिक बाल कूप पैटर्न इन रोम को स्थानीयकृत रहे E14.5 पर epidermis में और E15.5 melanoblasts से आकार लेती है. Melanoblast / मेलानोसाईट विकास की समीक्षा के लिए थॉमस और एरिक्सन (2008) 1 देखें. Melanoblast आबादी लेबल करने के क्रम में हम Tyr संयुक्त है :: सशर्त ROSA26 ठिकाना 9 से पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त कि R26YFPR जानवरों के साथ माउस tyrosinase प्रमोटर 8 से प्रेरित Cre पर recombinase व्यक्त कि CREB जानवरों.
हम एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग संस्कृति भ्रूण त्वचा और छवियों पर कब्जा करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह रंडी एट अल में वर्णित मूल विधि. (2010) 6 प्रपत्र अनुकूलित है. वर्तमानविधि 6 अच्छी तरह प्रारूप में इमेजिंग की अनुमति देता है और संस्कृति का समर्थन करने के Nuclepore झिल्ली पर और Matrigel पर निर्भरता को हटा. इसके बजाय भ्रूण त्वचा को स्थिर करने के लिए 1% agarose की एक छोटी सी ब्लॉक का उपयोग. Matrigel पर निर्भरता को हटा रहा है, विशेष रूप से घुलनशील वृद्धि कारकों को भ्रूण त्वचा की प्रतिक्रिया का अध्ययन का ध्यान केंद्रित है, जहां स्थितियों में महत्वपूर्ण है. हमारी मूल विधि पहले से ही melanoblast विकास 10-13 में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और हम हम यहाँ वर्णन सुधार एकाधिक समानांतर संस्कृतियों एक आवश्यकता है, विशेष रूप से जहां एक प्रयोगात्मक तकनीक के रूप में इसे और अधिक शक्तिशाली बनाने करेंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम उल्टे confocal सूक्ष्मदर्शी पर करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग उत्तरदायी ख़ासियत है कि संस्कृति भ्रूण त्वचा के लिए एक विधि का वर्णन. विधि 6 संस्कृतियों समानांतर में imaged और Matrigel और मूल विधि 6 की Nuclepore झिल्ली पर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम चिकित्सा अनुसंधान परिषद से मूल धन से समर्थन किया था. हम तकनीकी चित्र तैयार करने के लिए क्रेग निकोल के लिए आभारी हैं. हम उनके इमेजिंग समर्थन के लिए मैथ्यू पियर्सन और पॉल पेरी के लिए आभारी हैं.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
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