Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.
Melanoblastos são a crista neural precursores de melanócitos derivados; as células responsáveis pela produção do pigmento na pele e no cabelo. Melanoblastos migra através da epiderme do embrião onde subsequentemente colonizar o cabelo desenvolver folículos 1,2. Migração das células da crista neural é amplamente estudada in vitro, mas em métodos in vivo ainda não estão bem desenvolvidos, especialmente em sistemas de mamíferos. Uma alternativa é a utilização ex vivo de cultura organotípica 3-6. Cultura de rato embrionário pele requer a manutenção de uma interface ar-líquido (ALI) em toda a superfície do tecido de 3,6. Alta resolução de imagem de live-rato pele embrionária tem sido dificultada pela falta de um bom método que não só mantém este ALI, mas também permite que a cultura seja invertida e, portanto, compatível com lentes objetivas de distância de trabalho curta e microscópios mais confocal. Este artigo descreve as recentes melhorias para a metanfetaminaod que utiliza uma membrana permeável a gás para superar estes problemas e permitir alta resolução de imagem confocal de pele embrionário em cultura ex vivo 6. Ao utilizar um melanoblasto específica Cre-recombinase expressa linha de rato combinado com a linha de repórter R26YFPR que são capazes de marcar por fluorescência da população melanoblasto dentro destas culturas de pele. A técnica permite ao vivo de imagem de melanoblastos e observação de seu comportamento e interações com o tecido em que se desenvolvem. Os resultados representativos são incluídos para demonstrar a capacidade de viver-imagem seis culturas em paralelo.
Tradicionalmente pele embrionária foi cultivada por dissecar a partir do embrião do rato e montagem em uma membrana de policarbonato Nuclepore. A membrana é então lançada em meio de cultura, mantendo, assim, uma interface ar-líquido através da superfície do tecido em desenvolvimento 3,4. Esta técnica tem sido utilizada para avaliar o comportamento melanoblasto pela fixação do tecido e a avaliação de distribuição melanoblasto usando β-galactosidase como marcador 7. Nós desenvolvemos um método que permite melanoblastos live-imaging de fluorescente etiquetado em ex vivo cultura pele 6. Aqui vamos descrever o método em detalhes de dissecação, a configuração, a viver de imagem confocal e incluem algumas melhorias recentes.
Melanoblastos são os precursores embrionários dos melanócitos, as células que produzem o pigmento no cabelo e na pele. Melanoblastos surgem na crista neural adjacente ao tubo neural embrionária por volta do dia 9 (E9) no rato em desenvolvimento embryo. Subsequentemente migram ao longo de um percurso entre a dorsolateral ectoderme e somitos desenvolvimento. No E12.5 eles se movem da derme para a epiderme, onde proliferam e continuar sua migração. O padrão primário folículo piloso começa a se formar na epiderme em E14.5 e E15.5 por melanoblastos está localizando a esses folículos. Para uma revisão do desenvolvimento melanoblasto / melanócito ver Thomas & Erickson (2008) 1. A fim de marcar a população melanoblasto combinamos Tyr :: CREB animais que expressam Cre-recombinase, conduzido pelo promotor de rato de tirosinase com 8 animais R26YFPR que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) condicionalmente a partir do locus Rosa26 9.
Nós descrevemos um método para cultura da pele e capturar imagens embrionárias usando um microscópio confocal invertido. É adaptado forma do método original descrito em Mort et al. (2010) 6. O presentemétodo permite a formação de imagens de um formato de 6 poços e elimina a dependência de membranas Nuclepore e em matrigel para suportar a cultura. Em vez disso, utilizando um pequeno bloco de agarose a 1% para estabilizar a pele embrionário. Removendo a dependência de matrigel é importante, especialmente em situações em que a resposta da pele embrionário a factores de crescimento solúveis é o foco de estudo. Nosso método original já foi usado para ganhar novos insights sobre o desenvolvimento melanoblasto 10-13 e nós antecipamos que as melhorias que descrevemos aqui vai torná-lo mais poderoso como uma técnica experimental, especialmente onde várias culturas paralelas são uma exigência.
Nós descrevemos um método para a cultura da pele embrionária que é particularidade passíveis de imagem de células vivas para a microscopia confocal invertidos. O método inclui os melhoramentos recentes que permitem seis culturas a ser trabalhada em paralelo e elimina a dependência de matrigel e membranas Nuclepore do método original 6. A diferença fundamental técnica a partir de técnicas similares é a utilização de uma membrana permeável ao gás lummox para estabelecer uma interface líquido d…
The authors have nothing to disclose.
O trabalho foi apoiado pelo financiamento de base do Conselho de Investigação Médica. Somos gratos a Craig Nicol para preparar desenhos técnicos. Somos gratos a Matthew Pearson e Paul Perry por seu apoio de imagem.
DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
Penicillin | Sigma | P3032 | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
Ethanol | Generic | ||
Live imaging chamber | Custom made | ||
Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
Agarose | Biogene | 300-300 | |
Fine pastette | Generic | ||
PBS | Generic | ||
Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
Toothbrush | Generic | ||
Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |