Ex vivo Kultur av Mouse embryonala Hud-och Live-avbildning av Melanoblast Migration
Summary
Vi beskriver dissekering och ex vivo kultur av mus embryonala hud. Odlingssystemet upprätthåller ett luft-vätskegränssnitt över vävnadsytan och tillåter avbildning på ett inverterat mikroskop. Melanoblasts, en komponent i utvecklings huden, är fluorescerande låta sitt uppträdande som skall iakttas med hjälp av konfokalmikroskopi.
Abstract
Melanoblasts är neurallisten härledda prekursorer av melanocyter; de celler som ansvarar för framställning av pigment i huden och håret. Melanoblasts migrerar genom epidermis hos embryot, där de därefter koloniserar utvecklings hårsäckar 1,2. Neural crest cell migration studerats in vitro men in vivo-metoder fortfarande inte väl utvecklad, speciellt i däggdjurssystem. Ett alternativ är att använda ex vivo organotypisk kultur 3-6. Kultur av mus embryonala hud kräver upprätthållandet av en luft-vätska gränssnitt (ALI) över ytan av vävnaden 3,6. Högupplöst levande avbildning av mus embryonala hud har försvårats av bristen på en bra metod som inte bara underhåller denna ALI men också tillåter den kultur som ska inverteras och därmed förenligt med kort arbetsavstånd objektiv och mest konfokala mikroskop. I denna artikel beskrivs de senaste förbättringarna till en method som använder ett gaspermeabelt membran för att övervinna dessa problem och tillåter hög upplösning konfokal avbildning av embryonal hud i ex vivo-kultur 6. Genom att använda en melanoblast specifik Cre-rekombinas uttrycker mus linje i kombination med R26YFPR reporter linjen har vi möjlighet att fluorescerande märka melanoblast befolkningen inom dessa hud kulturer. Tekniken möjliggör levande avbildning av melanoblasts och observation av deras beteende och interaktion med den vävnad där de utvecklas. Representativa resultat med för att påvisa förmågan att leva-bild 6 kulturer parallellt.
Introduction
Traditionellt embryonala hud har odlats genom att dissekera från musen embryot och montering på ett polykarbonat Nuclepore membran. Membranet är sedan flyta på odlingsmedium, och upprätthåller därmed en luft-vätske-gränssnitt över ytan av den utveckla vävnads 3,4. Denna teknik har använts för att analysera melanoblast beteende genom att fixera vävnaden och bedöma melanoblast fördelning med användning av β-galaktosidas som markör 7. Vi har utvecklat en metod som gör det möjligt för levande avbildning av fluorescerande melanoblasts i ex vivo hud kultur 6. Här beskriver vi metoden i detalj från dissektion, att installera, att leva konfokal avbildning och inkluderar några nya förbättringar.
Melanoblasts är de embryonala prekursorer till melanocyter, de celler som producerar pigment i hår och hud. Melanoblasts uppstår i neurallisten intill neuralröret på runt embryonala dag 9 (E9) i utvecklings musen embryo. Därefter de vandrar längs en dorsolaterala väg mellan ektoderm och utvecklings somites. Vid E12.5 de flyttar från dermis till epidermis där de föröka sig och fortsätta sin vandring. Den primära hårsäcken mönster börjar bildas i överhuden vid E14.5 och E15.5 melanoblasts är lokalisera dessa folliklar. För en genomgång av melanoblast / melanocyt utveckling ser Thomas & Erickson (2008) 1. För att märka melanoblast befolkningen har vi kombinerat Tyr :: CREB djur som uttrycker Cre-rekombinas driven av musen tyrosinas promotorn 8 med R26YFPR djur som uttrycker gula fluorescerande protein (YFP) villkorligt från ROSA26 locus 9.
Vi beskriver en metod att odla embryonala hud och fånga bilder med ett inverterat konfokalmikroskop. Den är anpassad form den ursprungliga metod som beskrivits i Mort et al. (2010) 6. FöreliggandeMetoden gör det möjligt att avbilda i en 6-brunnsformat och tar bort beroendet av Nuclepore membran och på matrigel att stödja odlingen. Istället för användning av ett litet block av 1% agaros för att stabilisera den embryonala hud. Ta bort beroendet matrigel är viktigt särskilt i situationer där svaret av embryonala hud till lösliga tillväxtfaktorer är i fokus för studien. Vår ursprungliga metoden har redan använts för att få nya insikter i melanoblast utveckling 10-13, och vi räknar med att de förbättringar som vi beskriver här kommer att göra det mer kraftfullt som en experimentell teknik särskilt där flera parallella kulturer är ett krav.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metod att odla embryonala hud som är egenhet mottaglig för live-cell imaging på inverterade konfokala mikroskop. Metoden innehåller de senaste förbättringarna som gör 6 kulturer som ska avbildas parallellt och tar bort beroendet av matrigel och Nuclepore membran av den ursprungliga metoden 6. Den avgörande tekniska skillnaden från liknande tekniker är användningen av ett gaspermeabelt TÖLP membran för att upprätta en luftvätskegränsytan och även för att fungera som ett täckg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av grundfinansiering från det medicinska forskningsrådet. Vi är tacksamma till Craig Nicol för att förbereda tekniska ritningar. Vi är tacksamma för Matthew Pearson och Paul Perry för deras avbildning stöd.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia dello sviluppo. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia dello sviluppo. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia dello sviluppo. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
