Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür
Summary
Biz fare embriyonik deri diseksiyonu ve ex vivo kültürünü açıklamak. Kültür sistemi doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüz korur ve bir ters mikroskop görüntüleme sağlar. Melanoblastlardan, gelişmekte olan derinin bir bileşeni olarak, flüoresan olarak davranışları konfokal mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir izin etiketlenir.
Abstract
Melanoblastlardan melanosit öncülerini türetilmiş nöral crest; cilt ve saç pigmenti üretmekten sorumlu hücreler. Melanoblastlardan bunlar daha sonra gelişmekte olan saç köklerinin 1,2 kolonize embriyonun epidermis içinden yer değiştirmektedir. Nöral krest hücre göçü yoğun in vitro çalışılmıştır ancak in vivo yöntemlere yine de özellikle memeli sistemlerinde, gelişmiş değildir. Bir alternatif ex vivo organotipik kültürü 3-6 kullanmaktır. Fare embriyonik deri Kültür 3,6 doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüzü (ALI) içinde bakım gerektirir. Fare embriyonik deri yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme Bu ALI korur ama aynı zamanda kültür ters ve kısa çalışma mesafesi objektif lens ve en konfokal mikroskoplar ile bu nedenle uyumlu sağlar değil, sadece iyi bir yöntem olmaması engel olmuştur. Bu makalede, bir meth son gelişmeleri anlatırod ki, bu sorunların üstesinden gelmek ve ex vivo kültür 6 embriyonik deri yüksek çözünürlüklü confocal görüntüleme sağlamak için gaz geçirgen bir zar kullanılır. Belirli bir melanoblast Kre-rekombinaz, R26YFPR raportör hattı ile birleştirilmiş fare hattı sentezleyen kullanarak biz flüoresan bu cilt kültürleri içinde melanoblast nüfus etiket edebiliyoruz. Teknik sağlar Melanoblastlardan ve onların davranış ve geliştirmek hangi doku ile etkileşimleri gözlem canlı görüntüleme. Temsilcisi sonuçları yeteneği canlı görüntü paralel olarak 6 kültürleri göstermek için dahil edilmiştir.
Introduction
Geleneksel olarak embriyonik cilt fare embriyo kesme ve bir polikarbonat Nuclepore zar üzerinde monte edilmesi ile kültive edilmiştir. Zar sonra bu şekilde gelişen doku 3,4 yüzeyine karşı bir hava-sıvı arayüz muhafaza, kültür ortamı üzerinde perdahlanır. Bu teknik, sabitleme ve doku bir işaretleyici 7 olarak β-galaktosidaz kullanan melanoblast dağıtım değerlendirerek melanoblast davranışı analiz etmek için kullanılmıştır. Ex vivo deri kültürü 6 canlı görüntüleme bölgesinin floresanla işaretlenmiş Melanoblastlardan izin veren bir yöntem geliştirdik. Burada konfokal görüntüleme yaşamak için, kurulum, diseksiyonu ayrıntılı yöntemini açıklamak ve bazı yeni geliştirmeler içerir.
Melanoblastlardan melanosit embriyonik öncüleri, saç ve deri pigment üreten hücrelerdir. Melanoblastlardan gelişmekte olan fare e embriyonik gün 9 (E9) civarında nöral tüp bitişik olarak ortaya çıkan nöralmbryo. Daha sonra bunlar ektoderm ve gelişen Somitlerin arasında bir Dorsolateral yol boyunca göç ederler. E12.5 onlar çoğalırlar ve onların göç devam epidermis dermis taşımak. Birincil saç folikülü model bu köklerinin lokalize olan E14.5 de epidermis ve E15.5 Melanoblastlardan ile oluşmaya başlar. Melanoblast / melanosit gelişme gözden Thomas ve Erickson (2008) 1 bkz. Melanoblast nüfusu etiketlemek için biz Tyr kombine :: şartlı ROSA26 mahaline 9 sarı floresan protein (YFP) ifade R26YFPR hayvan fare tyrosinase promoter 8 ile tahrik Kre-recombinase ifade CREB'ye hayvanlar.
Biz ters bir konfokal mikroskop kullanılarak kültür embriyonik deri ve yakalama görüntüleri bir yöntem açıklanmaktadır. Bu Mort et al, orijinal bir yöntem. (2010) 6 bir şekilde uyarlanmıştır. Şimdikiyöntem, 6-çukurlu formatta görüntüleme sağlar ve kültür desteklemek için, Nüklepor dokularından ve Matrigel üzerinde güven kaldırır. Bunun yerine embriyonik cildi dengelemek için% 1 agaroz küçük bir blok kullanarak. Matrigel üzerinde güven çıkarılması özellikle çözünür büyüme faktörlerine embriyonik derinin cevap çalışmasında odağı olduğu durumlarda önemlidir. Bizim orijinal yöntem zaten melanoblast gelişme 10-13 içine yeni anlayışlar kazanmak için kullanılır olmuştur ve biz burada açıklamak gelişmeler çoklu paralel kültürler bir gereklilik özellikle deneysel bir teknik olarak daha güçlü olmasını bekliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ters konfokal mikroskoplar üzerinde canlı hücre görüntüleme müsait özellıgıdır kültür embriyonik cilt için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi 6 kültürler paralel olarak görüntülü ve matrigel ve orijinal yönteme 6 Nüklepor zarlar üzerindeki güveni ortadan kaldırır izin son iyileştirmeler içerir. Benzer tekniklerinden önemli teknik bir fark, bir hava arayüzü sıvı kurmak için ve aynı zamanda bir lamel olarak hareket için bir gaz-geçirgen zarın lummox kullanılması…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Iş Tıbbi Araştırma Konseyi çekirdek fon tarafından desteklenmiştir. Biz teknik çizimlerini hazırlamak için Craig Nicol minnettarız. Biz onların görüntüleme desteği için Matthew Pearson ve Paul Perry minnettarız.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Riferimenti
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia dello sviluppo. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia dello sviluppo. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia dello sviluppo. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
