Inducida por láser Breakdown Spectroscopy: un nuevo enfoque para el mapeo y cuantificación de nanopartículas en tejidos de órganos
Summary
Desglose espectroscopia inducida por láser se realiza en órgano fino y tejido del tumor con éxito detectado elementos naturales y gadolinio inyectado artificialmente (Gd), emitidas a partir de nanopartículas a base de D-os. Imágenes de los elementos químicos alcanzaron una resolución de 100 micras y la sensibilidad cuantitativa sub-mM. La compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes de un mismo tejido biológico.
Abstract
Espectroscopía de emisión de plasma inducida por láser se aplicó a análisis elemental de las muestras biológicas. Espectroscopía de descomposición inducida por láser (LIBS) realizado en secciones finas de tejidos de roedores: riñones y el tumor, permite la detección de elementos inorgánicos tales como (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, y Fe, presente de forma natural en el cuerpo y (ii) Si y Di-s, detectados después de la inyección de nanopartículas a base de gadolinio. Los animales fueron sacrificados 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de partículas. Una exploración bidimensional de la muestra, lleva a cabo utilizando una micrométrico-etapa 3D motorizado, permite el haz de láser infrarrojo explorar la superficie con una resolución lateral de menos de 100 μ m. Imágenes químico cuantitativo de elemento de Di-s en el interior del órgano se obtuvieron con sensibilidad sub-mM. LIBS ofrece un método simple y robusto para estudiar la distribución de materiales inorgánicos sin ningún labeli específicang. Por otra parte, la compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes del mismo tejido biológico con diferentes tipos de respuesta: elemental, moleculares o celulares.
Introduction
El amplio desarrollo de las nanopartículas para aplicaciones biológicas instó a la mejora paralela de técnicas analíticas para su cuantificación y de formación de imágenes en muestras biológicas. Por lo general, la detección y el mapeo de las nanopartículas en los órganos son hechas por fluorescencia o microscopía confocal. Desafortunadamente estos métodos requieren el etiquetado de las nanopartículas por un colorante de infrarrojo cercano que puede modificar la biodistribución de las nanopartículas, especialmente para nanopartículas muy pequeñas debido a sus propiedades hidrófobas. La detección de nanopartículas marcadas, y en especial las nanopartículas muy pequeñas (de tamaño <10 nm), por lo tanto podría interferir con su biodistribución en toda la escala del cuerpo, sino también en los tejidos y de células niveles. El desarrollo de nuevos dispositivos capaces de detectar las nanopartículas sin ningún etiquetado ofrece nuevas posibilidades para el estudio de su comportamiento y la cinética. Por otra parte, el papel de los elementos traza tales como hierro y cobre en el cerebro enfermedades Und enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1, de Menkes 2,3, o Wilson 4 sugieren el interés para estudiar y localizar estos elementos en los tejidos.
Diversas técnicas se han utilizado para proporcionar el mapeo elemental o microanálisis de diferentes materiales. En su artículo de revisión publicado en 2006, R. lobinski et al. Proporcionan una visión general de las técnicas estándar disponibles para microanálisis elemental en el entorno biológico, uno de los entornos más difíciles para las ciencias analíticas 5. La microsonda de electrones, que se compone de energía dispersiva de microanálisis de rayos X en un microscopio electrónico de transmisión, se puede aplicar a numerosos estudios si la concentración elemento es suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para llegar a los límites de detección más bajos, se han utilizado las siguientes técnicas:
- microsonda haz de iones usando partículas inducida por rayos X de emisión μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanálisis radiación μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- espectrometría de masas de iones secundarios SIMS (0,1 mg / g) 8
- la ablación con láser acoplado inductivamente espectrometría de masas LA-ICP-MS (hasta 0,01 mg / g) 9,10
Las técnicas mencionadas anteriormente-proporcionan una resolución micrométrica como se muestra en la Tabla 1 extraído de lobinski et al.
Reconstrucción 3D de las investigaciones en 2D de serie también se podría proponer para la reconstrucción de los tejidos más profundos 11. Sin embargo, todos los dispositivos y sistemas requieren tanto de los profesionales cualificados, moderados a equipos muy caros y los experimentos de larga duración (por lo general más de 4 h para una 100 m x 100 m para μ-SXRF y 10 mm x 10 mm de LA-ICP-MS ) 12. En conjunto, estos requisitos hacen microanálisis elemental muy restrictivo e incompatible con los sistemas de imagen óptica convencionales,microscopía de fluorescencia o microscopía no lineal. Otro punto que se puede mencionar es que la capacidad de medición cuantitativa es aún bastante limitado y depende de la disponibilidad de las normas de laboratorio con ajuste matricial. La mayor generalización del uso de microanálisis elemental en procesos de la industria, la geología, la biología y otras áreas de aplicaciones generará avances conceptuales y tecnológicos significativos.
El propósito de la presente manuscrito es proponer soluciones para el mapeo elemental cuantitativo (o microanálisis elemental) en los tejidos biológicos con una instrumentación mesa totalmente compatible con la microscopía óptica convencional. Nuestro enfoque se basa en la espectroscopía de descomposición inducida por láser (tecnología LIBS). En LIBS, un pulso de láser se enfoca en la muestra de interés para crear la descomposición y la chispa del material. La radiación emitida atómica en el plasma se analizó posteriormente por un espectrómetro y la elementalconcentraciones mentales se pueden recuperar con las medidas de calibración realizados previamente 13,14. Las ventajas de LIBS incluyen sensibilidad (g / g para casi todos los elementos), la compacidad, la preparación de la muestra muy básico, ausencia de contacto con la muestra, respuesta instantánea y precisamente localizada (micro) análisis de superficie. Sin embargo, la aplicación de imagen química del tejido sigue siendo un reto ya que la ablación con láser de tejido debe ser controlado finamente para realizar mapas con alta resolución espacial, junto con la sensibilidad en el rango g / g 15,16.
Con esa solución, no se necesita la adición de trazadores o agentes de etiquetado, que permite la detección de elementos inorgánicos directamente en su entorno nativo en los tejidos biológicos. El instrumento LIBS desarrollado en nuestro laboratorio ofrece una resolución de corriente inferior a 100 micras con una sensibilidad estimada para Di-s por debajo de 35 g / g, equivalente a 0,1 mM de 16, lo que permitela asignación de muestras grandes (> 1 cm 2) dentro de 30 min. Además, el software hecho en casa facilita la adquisición y explotación de los datos. Este instrumento se utiliza para detectar, cartografiar y cuantificar la distribución tisular de gadolinio nanopartículas (Gd) basados en 17 a 18 en los riñones y muestras de tumores de animales pequeños, de 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de las partículas (tamaño <5 nm) . Elementos inorgánicos, que son intrínsecamente contenidas en un tejido biológico, tales como Fe, Ca, Na, y P, también se han detectado y fotografiado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicado a la muestra biológica, esta técnica permite que la imagen química, es decir, el mapeo y cuantificación, de Di-s y Si a partir de nanopartículas basadas-Di-s inyectados en diferentes órganos. A partir de los ajustes principales críticos, el control de las propiedades de láser (longitud de onda, la energía de pulso, de enfoque, y de estabilidad) es crítico para una ablación del tejido preciso y fino (es decir, una resolución de mapeo), así como para la sensibilidad. Trabajar en la …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero de la Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Riferimenti
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