Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes's Mapping en kwantificering in orgaanweefsel
Summary
Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.
Abstract
Emissie spectroscopie van laser geïnduceerde plasma werd toegepast voor elementaire analyse van biologische monsters. Laser geïnduceerde afbraak spectroscopie (LIBS) uitgevoerd op dunne secties knaagdier weefsels: nieren en tumor, maakt de detectie van anorganische elementen zoals (i) Na, Ca, Cu, Mg, P en Fe, van nature aanwezig in het lichaam en (ii) Si en Gd, geconstateerd na de injectie van gadolinium gebaseerde nanodeeltjes. De dieren werden gedood 1 tot 24 uur na intraveneuze injectie van deeltjes. Een twee-dimensionale scan van het monster uitgevoerd met een gemotoriseerde micrometrische 3D-fase kon de infrarode laserstraal verkennen het oppervlak met een laterale resolutie van minder dan 100 μ m. Kwantitatieve chemische beelden van Gd element in het orgel werden verkregen met sub-mm gevoeligheid. LIBS biedt een eenvoudige en robuuste methode om de distributie van anorganische materialen te bestuderen zonder enige specifieke labelIng. Bovendien, de verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel ervan om meerdere beelden van hetzelfde biologisch weefsel te voorzien van verschillende soorten respons: elementair, moleculaire of cellulaire.
Introduction
De brede ontwikkeling van nanodeeltjes voor biologische toepassingen drong er bij de parallelle verbetering van analytische technieken voor hun kwantificering en beeldvorming in biologische monsters. Meestal zijn de detectie en het in kaart brengen van de nanodeeltjes in organen door fluorescentie of confocale microscopie. Helaas zijn deze methoden vereisen de etikettering van de nanodeeltjes door een nabij-infrarood kleurstof die de biologische verdeling van de nanodeeltjes kunnen wijzigen, in het bijzonder voor zeer kleine nanodeeltjes vanwege de hydrofobe eigenschappen. De detectie van gelabelde nanodeeltjes, en vooral de zeer kleine nanodeeltjes (grootte <10 nm), kan aldus interfereren met hun biologische verdeling op het gehele weegschaal maar ook op de weefsels en cellen niveaus. De ontwikkeling van nieuwe apparaten om nanodeeltjes te detecteren zonder etikettering biedt nieuwe mogelijkheden voor de studie van hun gedrag en kinetiek. Bovendien is de rol van sporenelementen zoals ijzer en koper in de hersenen ziekten eend neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer 1, Menkes 2,3 of Wilson 4 suggereren het belang bestuderen en lokaliseren deze elementen in weefsels.
Verschillende technieken zijn gebruikt om elementaire mapping of microanalyse van verschillende materialen. In hun overzichtsartikel gepubliceerd in 2006, R. Lobinski et al.. Gaf een overzicht van de beschikbare standaard technieken voor elementaire analyse in biologische omgeving, een van de meest uitdagende omgevingen voor analytische wetenschappen 5. De elektronen microprobe, die bestaat uit energie dispersieve röntgen microanalyse in een transmissie elektronenmicroscoop, kan op talrijke studies als het element voldoende concentratie (> 100-1000 ug / g). Lagere detectielimieten te bereiken, zijn de volgende technieken gebruikt:
- ionenbundel microprobe behulp deeltje geïnduceerde röntgenstraling μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
- synchrotron straling microanalyse μ-SXRF (0,1-1 ug / g) 7
- secundaire ionen massaspectrometrie SIMS (0,1 ug / g) 8
- laser ablatie inductief gekoppelde massaspectrometrie LA-ICP-MS (tot 0,01 ug / g) 9,10
De bovengenoemde technieken die micrometrische resolutie zoals weergegeven in tabel 1 onttrokken Lobinski et al..
3D-reconstructie van seriële 2D onderzoek kan ook worden voorgesteld voor de wederopbouw van diepere weefsels 11. Echter, alle apparaten en systemen vereisen beide gekwalificeerde professionals, matig tot zeer dure apparatuur en langdurige experimenten (meestal meer dan 4 uur voor een 100 urn x 100 urn voor μ-SXRF en 10 mm x 10 mm voor LA-ICP-MS ) 12. In totaal hebben deze eisen te maken elementaire analyse zeer beperkende en onverenigbaar met conventionele optische imaging-systemen,fluorescentie microscopie of niet-lineaire microscopie. Een ander punt dat we hier kunnen noemen is dat de kwantitatieve meting mogelijkheid is nog vrij beperkt en afhankelijk van de beschikbaarheid van matrixgekoppelde laboratorium normen. De verdere veralgemening van het gebruik van elementaire analyse in de industrie processen, geologie, biologie en andere domeinen van de aanvragen zal belangrijke conceptuele en technologische doorbraken te genereren.
Het doel van dit manuscript oplossingen voor kwantitatieve elementaire mapping (of elementaire microanalyse) in biologische weefsels voorstellen met een tafelblad instrumentatie volledig compatibel met conventionele optische microscopie. Onze benadering is gebaseerd op de laser-geïnduceerde afbraak spectroscopie (LIBS technologie). In LIBS, wordt een laserpuls gericht op het monster van belang zijn voor de afbraak en vonk van het materiaal te maken. De atomaire straling die in het plasma wordt vervolgens geanalyseerd door een spectrometer en de elementaireTal concentraties kan worden opgehaald met kalibratie metingen vooraf 13,14. De voordelen van LIBS omvatten gevoeligheid (ug / g voor bijna alle elementen), compactheid, zeer eenvoudig monstervoorbereiding, geen contact met het monster, onmiddellijke reactie en nauwkeurig gelokaliseerd (micro) oppervlakteanalyse. De toepassing van weefsel chemische beeldvorming blijft een uitdaging omdat de laser ablatie van weefsel fijn worden geregeld om kaarten te voeren met hoge ruimtelijke resolutie met gevoeligheid in ug / g bereik 15,16.
Met een dergelijke oplossing, is de toevoeging van tracers of etikettering agenten niet nodig, die het mogelijk maakt het opsporen van anorganische elementen rechtstreeks in hun eigen omgeving in biologische weefsels. De LIBS instrument ontwikkeld in ons laboratorium heeft een huidige resolutie lager dan 100 urn voor een gevoeligheid voor Gd beneden 35 ug / g, overeenkomend met 0,1 mM 16, waardoorhet in kaart brengen van grote monsters (> 1 cm 2) binnen 30 minuten. Daarnaast zelfgemaakte software vergemakkelijkt de verwerving en exploitatie van de gegevens. Dit instrument wordt gebruikt voor het detecteren, kaart, en kwantificeren van de weefsel verdeling van gadolinium (Gd)-gebaseerde nanodeeltjes 17-18 in de nieren en de tumor monsters van kleine dieren, 1-24 uur na intraveneuze injectie van de deeltjes (grootte <5 nm) . Anorganische elementen, die intrinsiek in een biologisch weefsel, zoals Fe, Ca, Na, en P, zijn ook gedetecteerd en afgebeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toegepast op biologisch monster, deze techniek maakt het mogelijk de chemische beeldvorming, namelijk het in kaart brengen en kwantificeren, van Gd en Si uit geïnjecteerd Gd-gebaseerde nanodeeltjes in verschillende organen. Van de belangrijkste kritische instellingen, de controle laser eigenschappen (golflengte, pulsenergie, focus en stabiliteit) is essentieel voor een nauwkeurige en fijne weefsel ablatie (bijvoorbeeld mapping resolutie) en voor gevoeligheid. Werken bij hoge energie zorgt voor een bet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zeer erkentelijk voor de financiële steun door de Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Riferimenti
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chimica. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
