Laser-induceret Fordeling spektroskopi: En ny tilgang til Nanopartikel kortlægning og kvantificering i Organ Tissue
Summary
Laser-induceret opdeling spektroskopi udført på tynd orgel og tumorvæv held opdaget naturlige elementer og kunstigt indsprøjtet gadolinium (Gd), udstedt fra Gd-baserede nanopartikler. Billeder af kemiske elementer nåede en opløsning på 100 um og kvantitativ sub-mM følsomhed. Foreneligheden af opsætningen med standard optisk mikroskopi fremhæver sit potentiale til at levere flere billeder af den samme biologisk væv.
Abstract
Emissionsspektroskopi laser-induceret plasma blev anvendt til elementært analyse af biologiske prøver. Laser-induceret nedbrydning spektroskopi (LIBS) udført på tynde snit af gnaver væv: nyrer og tumor, muliggør påvisning af uorganiske elementer, såsom (i) Na, Ca, Cu, Mg, P og Fe, der naturligt forekommer i kroppen, og (ii) Si og Gd detekteret efter injektion af gadolinium-baserede nanopartikler. Dyrene blev aflivet 1 til 24 timer efter intravenøs injektion af partikler. En to-dimensional scanning af prøven, udføres ved hjælp af en motoriseret mikrometrisk 3D-fase tillod infrarød laserstråle udforske overfladen med en lateral opløsning på mindre end 100 μ m. Kvantitative kemiske billeder af Gd element inde i orglet blev opnået med sub-mM følsomhed. LIBS tilbyder en enkel og robust metode til at studere fordelingen af uorganiske materialer uden nogen specifik labeling. Desuden understreger forenelighed opsætning med standard optisk mikroskopi sit potentiale til at levere flere billeder af den samme biologiske væv med forskellige typer af reaktion: elementært, molekylære eller cellulære.
Introduction
Den brede udvikling af nanopartikler for biologiske anvendelser opfordrede sideløbende forbedring af analytiske teknikker til kvantificering og billeddannelse i biologiske prøver. Normalt påvisning og kortlægning af nanopartikler i organerne er lavet af fluorescens eller konfokal mikroskopi. Desværre er disse metoder kræver mærkning af nanopartikler af et nær-infrarødt farvestof, der kan ændre biodistributionen af nanopartikler, især for meget små nanopartikler på grund af dets hydrofobe egenskaber. Afsløringen af mærkede nanopartikler, og især de meget små nanopartikler (størrelse <10 nm), kunne således forstyrre deres biofordeling på hele kroppen målestok, men også på de væv og celler niveauer. Udviklingen af nye enheder i stand til at opdage nanopartikler uden nogen mærkning giver nye muligheder for at studere deres adfærd og kinetik. Desuden rolle sporstoffer som jern og kobber i hjernen sygdomme end neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers 1, Menkes 2,3 eller Wilson 4 antyder interesse for at studere og lokalisere disse elementer i væv.
Forskellige teknikker er blevet anvendt til at levere elementært kortlægning eller mikroanalyse af forskellige materialer. I deres gennemgang papir blev offentliggjort i 2006, R. Lobinski et al. Gav et overblik over tilgængelige standard teknikker til elementært mikroanalyse i biologisk miljø, en af de mest udfordrende miljøer for analytiske videnskaber 5. Den elektronmikrosonde, som består af energi Dispersive X-ray mikroanalyse i et transmissionselektronmikroskop, kan anvendes til en lang række undersøgelser, hvis koncentrationen af elementet er tilstrækkelig (> 100-1.000 ug / g). For at nå lavere detektionsgrænser, har følgende teknikker været anvendt:
- ionstråler mikrosonde hjælp partikel induceret røntgen emission μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
- SYNchrotron stråling mikroanalysen μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7.
- sekundær ion-massespektrometri SIMS (0,1 ug / g) 8
- laserablation induktivt koblet massespektrometri LA-ICP-MS (ned til 0,01 pg / g) 9,10
Ovennævnte teknikker giver mikrometrisk opløsning som vist i tabel 1 ekstraheret fra Lobinski et al.
Kunne der også foreslås 3D-rekonstruktion af serielle 2D undersøgelser til genopbygning af dybere væv 11. Men alle enheder og systemer kræver både kvalificerede fagfolk, moderat til højt dyrt udstyr og langvarige eksperimenter (typisk mere end 4 timer for en 100 mM x 100 mM for μ-SXRF og 10 mm x 10 mm for LA-ICP-MS ) 12.. Tilsammen er disse krav gør elementært mikroanalyse meget begrænsende og uforenelig med konventionelle optiske billeddannende systemer,fluorescensmikroskopi eller ulineær mikroskopi. Et andet punkt, som vi kan nævne her, er, at den kvantitative måling kapacitet er stadig ret begrænset og afhænger af tilgængeligheden af matrixtilpassede laboratoriestandarder. Den yderligere generalisering af anvendelsen af elementært mikroanalysen i industriprocesser, geologi, biologi og andre områder af applikationer vil generere betydelige konceptuelle og teknologiske gennembrud.
Formålet med det nuværende manuskript er at foreslå løsninger til kvantitativ elementært kortlægning (eller elementært mikroanalyse) i biologiske væv med en bordplade instrumentering fuldt kompatibel med konventionel optisk mikroskopi. Vores tilgang er baseret på laser-induceret opdeling spektroskopi (LIBS teknologi). I LIBS, er en laser puls fokuseret på prøve af interesse for at skabe sammenbrud og gnist af materialet. Det atomare stråling, der udsendes i plasmaet efterfølgende analyseret ved et spektrometer og eleTal koncentrationer kan hentes med kalibrering målinger udført på forhånd 13,14. Fordelene ved LIBS omfatter følsomhed (pg / g for næsten alle de elementer), kompakthed, meget grundlæggende prøveforberedelse, manglende kontakt med prøven, øjeblikkelig respons og præcist lokaliseret (mikro) overflade analyse. Anvendelsen af væv kemisk billeddannelse er stadig en udfordring, da laser ablation af væv skal fint styret til at udføre kort med høj rumlig opløsning sammen med følsomhed i ug / g interval 15,16.
Med en sådan løsning, er adjunction af sporstoffer eller etikettering agenter ikke nødvendigt, som gør det muligt at opdage uorganiske elementer direkte i deres oprindelige miljø i biologiske væv. LIBS instrument udviklet i vores laboratorium har en nuværende opløsning mindre end 100 um med en anslået følsomhed til Gd under 35 ug / g, svarende til 0,1 mM 16, hvilket tilladerkortlægning af store prøver (> 1 cm 2) inden for 30 min. Desuden hjemmelavet software letter køb og udnyttelse af data. Dette instrument anvendes til at detektere, kort og kvantificere vævsfordelingen af gadolinium (Gd)-baserede nanopartikler 17 – 18 i nyrer og tumor prøver fra små dyr, 1 til 24 timer efter intravenøs injektion af partiklerne (størrelse <5 nm) . Uorganiske stoffer, som er indeholdt i en biologisk væv, såsom Fe, Ca, Na, og P, er også blevet opdaget og afbildet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendt til biologisk prøve, tillader denne teknik den kemiske billeddannelse, dvs kortlægning og kvantificering af Gd og Si fra injicerede Gd-baserede nanopartikler i forskellige organer. Fra de vigtigste kritiske indstillinger, styring af laser egenskaber (bølgelængde, puls energi, fokus og stabilitet) er afgørende for en præcis og fin vævsablation (dvs. kortlægning opløsning) samt for følsomhed. Arbejde ved høje energi giver en bedre følsomhed, men desværre genererer nedbrudt rumlig opl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker for finansiel støtte fra LABEX-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Riferimenti
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chimica. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
