लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी: अंग के ऊतकों में nanoparticle की मैपिंग और मात्रा का ठहराव के लिए एक नया दृष्टिकोण
Summary
पतली अंग और ट्यूमर के ऊतक पर प्रदर्शन लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी सफलतापूर्वक जी.डी. आधारित नैनोकणों से जारी प्राकृतिक तत्वों और कृत्रिम रूप से इंजेक्शन Gadolinium (जी डी), का पता चला. रासायनिक तत्वों की छवियाँ 100 माइक्रोन और मात्रात्मक उप मिमी संवेदनशीलता का एक संकल्प पर पहुंच गया. मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ सेटअप की अनुकूलता एक ही जैविक ऊतक के एकाधिक छवियों को प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता पर जोर दिया.
Abstract
लेजर प्रेरित प्लाज्मा के उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी जैविक नमूने के मौलिक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था. लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी (LIBS) कृंतक ऊतकों की पतली वर्गों पर प्रदर्शन: गुर्दे और ट्यूमर, की अनुमति देता है इस तरह (मैं) ना, सीए, घन, मिलीग्राम, पी, और फे, शरीर में प्राकृतिक रूप से मौजूद और अकार्बनिक तत्वों का पता लगाने (ii) सी और जी.डी., gadolinium आधारित नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद पता चला. जानवरों के कणों की नसों में इंजेक्शन के बाद 1-24 घंटे euthanized थे. नमूने के एक दो आयामी स्कैन, अवरक्त लेजर बीम एक पार्श्व संकल्प कम से कम 100 μ मीटर के साथ सतह की खोज की अनुमति दी, एक मोटर चालित micrometric 3 डी में मंच का उपयोग कर प्रदर्शन किया. अंग अंदर जी.डी. तत्व के मात्रात्मक रासायनिक छवियों उप मिमी संवेदनशीलता के साथ प्राप्त किया गया. LIBS किसी भी विशिष्ट labeli बिना अकार्बनिक सामग्री के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक सरल और मजबूत तरीका प्रदान करता हैएनजी. , मौलिक आणविक, या सेलुलर: इसके अलावा, मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ सेटअप की अनुकूलता प्रतिक्रिया के विभिन्न प्रकारों के साथ ही जैविक ऊतक के एकाधिक छवियों को प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता पर जोर दिया.
Introduction
जैविक अनुप्रयोगों के लिए नैनोकणों के व्यापक विकास के लिए जैविक नमूने में उनकी मात्रा का ठहराव और इमेजिंग के लिए विश्लेषणात्मक तकनीकों के समानांतर सुधार का आग्रह किया. आमतौर पर अंगों में नैनोकणों का पता लगाने और मानचित्रण प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा बनाई गई हैं. दुर्भाग्य से इन तरीकों को विशेष रूप से अपनी हाइड्रोफोबिक गुणों के कारण बहुत छोटे नैनोकणों के लिए, नैनोकणों के biodistribution संशोधित कर सकते हैं कि एक निकट अवरक्त डाई द्वारा नैनोकणों की लेबलिंग की आवश्यकता होती है. लेबल नैनोकणों, और विशेष रूप से बहुत छोटे नैनोकणों (आकार <10 एनएम) का पता लगाने, इस प्रकार पूरे शरीर पैमाने पर, लेकिन यह भी ऊतक और सेल के स्तर पर उनके biodistribution के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. किसी भी लेबलिंग के बिना नैनोकणों पता लगाने में सक्षम नए उपकरणों के विकास के लिए उनके व्यवहार और कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए नई संभावनाएं प्रदान करता है. इसके अलावा, इस तरह के मस्तिष्क में लोहे और तांबे के रूप में तत्वों का पता लगाने की भूमिका एक बीमारियोंअल्जाइमर 1, Menkes 2,3, या विल्सन के रूप में 4 डी neurodegenerative रोगों के ऊतकों में इन तत्वों का अध्ययन करने और स्थानीय बनाना ब्याज सुझाव देते हैं.
विभिन्न तकनीकों विभिन्न सामग्रियों की मौलिक मानचित्रण या microanalysis प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. 2006 में प्रकाशित उनकी समीक्षा पत्र में, आर Lobinski एट अल. जैविक पर्यावरण, विज्ञान विश्लेषणात्मक 5 के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण वातावरण में से एक में मौलिक microanalysis के लिए उपलब्ध मानक तकनीक का एक सिंहावलोकन प्रदान की. तत्व एकाग्रता पर्याप्त है अगर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ऊर्जा फैलानेवाला एक्स – रे microanalysis के होते हैं जो इलेक्ट्रॉन Microprobe, कई अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है (> 100-1,000 माइक्रोग्राम / छ). कम का पता लगाने सीमा तक पहुंचने के लिए, निम्न तकनीक का इस्तेमाल किया गया है:
- का उपयोग आयन बीम Microprobe कण प्रेरित एक्स – रे उत्सर्जन μ-PIXE (1-10 ग्राम / छ) 6
- चींटीविकिरण microanalysis μ-SXRF chrotron (0.1-1 ग्राम / छ) 7
- माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री Sims (0.1 माइक्रोग्राम / छ) 8
- लेजर पृथक उपपादन (नीचे 0.01 माइक्रोग्राम / छ) ला आईसीपी एमएस 9,10 मास स्पेक्ट्रोमेट्री युग्मित
Lobinski एट अल से निकाले तालिका 1 में दिखाया गया है उपर्युक्त तकनीक micrometric संकल्प प्रदान करते हैं.
धारावाहिक 2D जांच के 3D पुनर्निर्माण भी गहरे ऊतकों 11 के पुनर्निर्माण के लिए प्रस्तावित किया जा सकता है. हालांकि, सभी उपकरणों और प्रणालियों दोनों बेहद महंगे उपकरण के लिए उदार योग्य पेशेवरों, और लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों (एक μ-SXRF के लिए एक्स 100 माइक्रोन 100 माइक्रोन और ला आईसीपी एमएस के लिए x 10 मिमी 10 मिमी के लिए आम तौर पर अधिक से अधिक 4 घंटा की आवश्यकता ) 12. कुल मिलाकर, इन आवश्यकताओं, मौलिक microanalysis बहुत सीमित और पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम के साथ असंगत बनाप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या nonlinear माइक्रोस्कोपी. हम यहां उल्लेख कर सकते हैं कि एक और मुद्दा मात्रात्मक माप क्षमता अभी भी काफी सीमित है और मैट्रिक्स से मिलान प्रयोगशाला मानकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. उद्योग प्रक्रियाओं, भूविज्ञान, जीव विज्ञान और अनुप्रयोगों के अन्य डोमेन में मौलिक microanalysis के उपयोग के आगे सामान्यीकरण महत्वपूर्ण वैचारिक और तकनीकी सफलताओं उत्पन्न होगा.
वर्तमान पांडुलिपि का उद्देश्य पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ पूरी तरह से संगत एक tabletop उपकरण के साथ जैविक ऊतकों में मात्रात्मक मौलिक मानचित्रण (या मौलिक microanalysis) के लिए समाधान का प्रस्ताव करने के लिए है. हमारा दृष्टिकोण लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी (LIBS प्रौद्योगिकी) पर आधारित है. Libs में, एक लेजर पल्स सामग्री के टूटने और चिंगारी पैदा करने के लिए ब्याज की नमूना पर केंद्रित है. प्लाज्मा में उत्सर्जित परमाणु विकिरण बाद में एक स्पेक्ट्रोमीटर और elemen से विश्लेषण किया हैताल सांद्रता 13,14 पहले से प्रदर्शन किया अंशांकन माप के साथ लिया जा सकता है. libs के फायदे, compactness, बहुत बुनियादी नमूना तैयार करने, नमूने के साथ संपर्क, तात्कालिक प्रतिक्रिया और ठीक स्थानीयकृत (माइक्रो) सतह विश्लेषण का अभाव (लगभग सभी तत्वों के लिए माइक्रोग्राम / छ) संवेदनशीलता शामिल हैं. ऊतक के लेजर पृथक सूक्ष्मता एक साथ माइक्रोग्राम / छ सीमा 15,16 में संवेदनशीलता के साथ उच्च स्थानिक संकल्प के साथ नक्शे प्रदर्शन करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए लेकिन, जब से ऊतक रासायनिक इमेजिंग के आवेदन चुनौती बनी हुई है.
इस तरह के समाधान के साथ, tracers या लेबलिंग एजेंटों के adjunction जैविक ऊतकों में उनके पैतृक वातावरण में सीधे अकार्बनिक तत्वों का पता लगाने की अनुमति देता है, जो की जरूरत नहीं है. हमारी प्रयोगशाला में विकसित LIBS साधन की अनुमति देता है जो 0.1 मिमी 16 के बराबर 35 माइक्रोग्राम / छ नीचे जी.डी. के लिए एक अनुमान के अनुसार संवेदनशीलता के साथ 100 माइक्रोन के लिए अवर एक मौजूदा संकल्प, प्रदान करता हैबड़े नमूनों का मिलान (> 1 सेमी 2) 30 मिनट के भीतर. इसके अलावा, घर का बना सॉफ्टवेयर डेटा के अधिग्रहण और शोषण की सुविधा. इस उपकरण gadolinium के ऊतक वितरण, नक्शे का पता लगाने, और यों इस्तेमाल किया जाता है (जी डी) आधारित नैनोकणों 17 – छोटे जानवरों से गुर्दे और ट्यूमर के नमूनों में 18, 1 कणों की नसों में इंजेक्शन के बाद घंटा 24 को (आकार <एनएम 5) . ऐसे फ़े, सीए, ना, और पी के रूप में आंतरिक रूप से एक जैविक ऊतक में समाहित कर रहे हैं जो अकार्बनिक तत्वों,,, यह भी पता लगाया है और imaged किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
जैविक नमूने के लिए लागू है, इस तकनीक विभिन्न अंगों में इंजेक्शन जी.डी. आधारित नैनोकणों से जी.डी. और सी की मैपिंग और मात्रा का ठहराव, यानी, रासायनिक इमेजिंग की अनुमति देता है. मुख्य महत्वपूर्ण सेटिंग्स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृतज्ञता LABEX-Imust द्वारा वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Riferimenti
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chimica. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
