Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ
Summary
Spettroscopia laser ripartizione indotta eseguita su organi sottile e tessuto tumorale rilevato con successo elementi naturali e gadolinio artificialmente iniettato (Gd), emessi da nanoparticelle a base di Gd. Immagini di elementi chimici raggiunto una risoluzione di 100 micron e sensibilità quantitativa sub-mM. La compatibilità del setup con la microscopia ottica standard sottolinea la sua capacità di fornire immagini multiple di uno stesso tessuto biologico.
Abstract
Spettroscopia di emissione di plasma indotto da laser è stato applicato ad analisi elementare di campioni biologici. Spettroscopia ripartizione laser-indotta (LIBS) eseguita su sezioni sottili di tessuti roditori: reni e tumorali, consente il rilevamento di elementi inorganici come (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, Fe e, naturalmente presenti nel corpo e (ii) Si e Gd, rilevati dopo l'iniezione di nanoparticelle a base di gadolinio. Gli animali sono stati sacrificati da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle. Una scansione bidimensionale del campione, effettuata utilizzando un micrometrica 3D-stadio motorizzato, ha permesso il raggio laser infrarosso esplorare la superficie con una risoluzione laterale di 100 μ m. Immagini chimica quantitativa di elemento Gd all'interno dell'organo sono stati ottenuti con sensibilità sub-mM. LIBS offre un metodo semplice e robusto per studiare la distribuzione di materiali inorganici senza labeli specificong. Inoltre, la compatibilità della configurazione con microscopia ottica standard sottolinea il suo potenziale di fornire immagini multiple dello stesso tessuto biologico con differenti tipi di risposte: elementari, molecolari o cellulari.
Introduction
L'ampio sviluppo di nanoparticelle per applicazioni biologiche sollecitato il parallelo miglioramento delle tecniche analitiche per la loro quantificazione e di imaging in campioni biologici. Solitamente la rilevazione e la mappatura delle nanoparticelle in organi sono fatti da fluorescenza o microscopia confocale. Sfortunatamente questi metodi richiedono l'etichettatura delle nanoparticelle da un colorante vicino infrarosso che può modificare la biodistribuzione delle nanoparticelle, in particolare per le piccolissime nanoparticelle per le sue proprietà idrofobiche. La rilevazione delle nanoparticelle etichettati, e soprattutto le piccole nanoparticelle (dimensioni <10 nm), potrebbe quindi interferire con la loro distribuzione biologica l'intera scala di corpo, ma anche a livello di tessuti e cellule. Lo sviluppo di nuovi dispositivi in grado di rilevare le nanoparticelle senza etichettatura offre nuove possibilità per lo studio del loro comportamento e cinetica. Inoltre, il ruolo di oligoelementi, quali ferro e rame nel cervello Malattie di unmalattie neurodegenerative come l'Alzheimer d 1, Menkes 2,3, o 4 Wilson suggeriscono l'interesse di studiare e localizzare questi elementi nei tessuti.
Varie tecniche sono state usate per fornire la mappatura microanalisi elementare o di materiali diversi. Nel loro articolo recensione pubblicata nel 2006, R. Lobinski et al. Ha fornito una panoramica delle tecniche disponibili standard per microanalisi elementare in ambiente biologico, uno degli ambienti più difficili per le scienze analitiche 5. Microsonda elettronica, che consiste di energia dispersiva microanalisi a raggi X in un microscopio elettronico a trasmissione, può essere applicato a numerosi studi se la concentrazione dell'elemento è sufficiente (> 100-1.000 mg / g). Per raggiungere limiti di rivelazione inferiori, sono state utilizzate le seguenti tecniche:
- microsonda fascio ionico usando particelle indotta da X-ray Emission μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanalisi radiazione μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- spettrometria di massa di ioni secondari SIMS (0.1 mg / g) 8
- ablazione laser accoppiato induttivamente spettrometria di massa LA-ICP-MS (fino a 0,01 mg / g) 9,10
Le tecniche sopra citate forniscono risoluzione micrometrica come mostrato nella Tabella 1 estratto da Lobinski et al.
Ricostruzione 3D delle indagini 2D di serie potrebbe essere proposto anche per la ricostruzione dei tessuti più profondi 11. Tuttavia, tutti i dispositivi e sistemi richiedono entrambi professionisti qualificati, moderati da attrezzature altamente costose ed esperimenti di lunga durata (in genere più di 4 ore per un 100 micron x 100 micron per μ-SXRF di 10 mm x 10 mm per LA-ICP-MS ) 12. Complessivamente, questi requisiti rendono microanalisi elementare molto limitazione e incompatibile con i sistemi di imaging ottico convenzionale,microscopia a fluorescenza o microscopia non lineare. Un altro punto che si può menzionare qui è che la capacità di misura quantitativa è ancora abbastanza limitata e dipende dalla disponibilità di standard di laboratorio accoppiata alla matrice. L'ulteriore generalizzazione dell'uso di microanalisi elementare nei processi industriali, la geologia, la biologia e altri domini di applicazioni apporterà notevoli progressi concettuali e tecnologiche.
Lo scopo della presente manoscritto è quello di proporre soluzioni per la mappatura elementare quantitativa (o microanalisi elementare) nei tessuti biologici con una strumentazione tavolo pienamente compatibile con microscopia ottica convenzionale. Il nostro approccio è basato sulla spettroscopia ripartizione indotta da laser (tecnologia LIBS). In LIBS, un impulso laser viene focalizzato sul campione di interesse per creare la composizione e la scintilla del materiale. La radiazione emessa atomico nel plasma viene successivamente analizzato da uno spettrometro e il elementariLe concentrazioni TAL possono essere recuperati con le misure di calibrazione effettuate in anticipo 13,14. I vantaggi di LIBS includono sensibilità (mcg / g per quasi tutti gli elementi), compattezza, preparazione molto semplice campione, assenza di contatto con il campione, risposta istantanea e localizzata precisamente (micro) analisi di superficie. Tuttavia, l'applicazione dell'imaging chimico tessuto rimane difficile dall'inizio della ablazione laser del tessuto deve essere finemente controllata effettuare mappe con elevata risoluzione spaziale e la sensibilità nell'intervallo mcg / g 15,16.
Con tale soluzione, non è richiesta l'aggiunzione di rivelatori o agenti di etichettatura, che permette di rilevare elementi inorganici direttamente nel loro ambiente nativo nei tessuti biologici. Lo strumento LIBS sviluppato nel nostro laboratorio offre una risoluzione corrente inferiore a 100 micron, con una sensibilità stimata per Gd inferiore a 35 mg / g, pari a 0,1 mM 16, che consentela mappatura di grandi campioni (> 1 cm 2) in 30 min. Inoltre, il software casalingo facilita l'acquisizione e lo sfruttamento dei dati. Questo strumento è utilizzato per rilevare, carta, e quantificare la distribuzione tissutale di gadolinio nanoparticelle basate (Gd) 17 – 18 nei reni e campioni tumorali da piccoli animali, da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle (dimensione <5 nm) . Elementi inorganici, che sono intrinsecamente contenute in un tessuto biologico, come Fe, Ca, Na, e P, sono stati rilevati e ripreso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Applicato al campione biologico, questa tecnica consente di imaging chimica, cioè la mappatura e quantificazione, di Do e Si iniettati da nanoparticelle a base di Gd in diversi organi. Dalle principali impostazioni critiche, il controllo delle proprietà del laser (lunghezza d'onda, energia dell'impulso, focalizzazione e stabilità) è fondamentale per una ablazione del tessuto preciso e fine (cioè risoluzione mapping), nonché per la sensibilità. Lavorare ad alta energia offre una migliore …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il sostegno finanziario da parte della Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Riferimenti
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