Laser-indusert sammenbrudd spektroskopi: En ny tilnærming for nanopartikkel Kartlegging og kvantifisering i Organ Tissue

Summary

Laser-indusert sammenbrudd spektroskopi utført på tynt orgel og svulstvev hell oppdaget naturlige elementer og kunstig injisert gadolinium (Gd), utstedt fra Gd-baserte nanopartikler. Bilder av kjemiske elementer nådde en oppløsning på 100 mikrometer og kvantitativ under mM følsomhet. Kompatibiliteten til oppsett med standard optisk mikrosstreker dens potensial til å gi flere bilder av en samme biologiske vev.

Abstract

Utslippsspektroskopi av laser-indusert plasma ble påført på elementær analyse av biologiske prøver. Laser-indusert nedbrytning spektroskopi (LIBS) utført på tynne snitt av gnager vev: nyrer og tumor, tillater påvisning av uorganiske elementer som (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, og Fe, naturlig tilstede i kroppen, og (ii) Si og Gd, detekteres etter injeksjon av gadolinium baserte nanopartikler. Dyrene ble avlivet 1 til 24 timer etter intravenøs injeksjon av partikler. En to-dimensjonal skanning av prøven, utført ved hjelp av en motorisert micrometric 3D-scenen, tillates den infrarøde laserstrålen utforsking av overflaten med en lateral oppløsning mindre enn 100 μ m. Kvantitative kjemiske bilder av Gd element inne i orgelet ble oppnådd med sub-MM følsomhet. LIBS gir en enkel og robust fremgangsmåte for å undersøke fordelingen av uorganiske materialer uten noen spesifikk labeling. Videre kompatibiliteten til oppsett med standard optisk mikrosstreker dens potensial til å gi flere bilder av den samme biologiske vev med ulike typer respons: elementære, molekylære, eller mobilnettet.

Introduction

Den brede utviklingen av nanopartikler for biologiske anvendelser oppfordret parallell forbedring av analytiske teknikker for deres kvantifisering og bildebehandling i biologiske prøver. Vanligvis påvisning og kartlegging av nanopartikler i organer er laget av fluorescens eller konfokalmikroskopi. Dessverre er disse metoder krever merking av nanopartikler av en nær infrarød fargestoff som kan modifisere den biologiske fordeling av nanopartikler, særlig for meget små nanopartikler som følge av sin hydrofobe egenskaper. Påvisning av merket nanopartikler, og særlig meget små nanopartikler (størrelse <10 nm), kan således forstyrre deres biodistribusjonen i hele kroppen skala, men også på vevs-og cellenivåene. Utviklingen av nye enheter i stand til å detektere nanopartikler uten noen merking gir nye muligheter for å studere deres oppførsel og kinetikk. Videre rollen av sporstoffer som jern og kobber i hjernen sykdommer end neurodegenerative sykdommer så som Alzheimer ^1, Menkes ^2,3 eller Wilson ⁴ antyder interesse for å studere og lokalisere disse elementene i vev.

Ulike teknikker har blitt brukt til å gi elementær kartlegging eller mikroanalyse av ulike materialer. I sin gjennomgang artikkel publisert i 2006, R. Lobinski et al. Gitt en oversikt over tilgjengelige standardteknikker for elementær mikroanalyse i biologiske miljøet, en av de mest utfordrende miljøer for analytiske vitenskaper ^fem. Den elektronmikrosonde, som består av energi dispersiv røntgenmikroanalyse i et transmisjonselektronmikroskop, kan anvendes på en rekke studier hvis elementkonsentrasjonen er tilstrekkelig (> de samtidig inntar 100-1000 ug / g). For å oppnå lavere deteksjonsgrenser, har de følgende teknikker vært benyttet:

• ionestråle ved hjelp av mikrosonde partikkel indusert røntgen utslipp μ-Pixe (1-10 pg / g) ⁶
• synchrotron stråling mikroanalyse μ-SXRF (0,1-1 mg / g) ⁷
• secondary ion mass spectrometry SIMS (0,1 ug / g) ⁸
• laserablasjon induktivt koblet massespektrometri LA-ICP-MS (ned til 0,01 ug / g) ^9,10

De ovennevnte teknikker gir micrometric oppløsningen som vist i tabell 1. ekstrahert fra Lobinski et al.

3D rekonstruksjon av serie 2D undersøkelser kan også bli foreslått for gjenoppbyggingen av dypere vev ^11. Men alle enheter og systemer krever både kvalifiserte fagfolk, moderat til svært kostbart utstyr og langvarige eksperimenter (vanligvis mer enn 4 timers for en 100 mikrometer x 100 mikrometer for μ-SXRF og 10 mm x 10 mm for LA-ICP-MS ) ^12. Til sammen er disse kravene gjør elemental mikroanalyse svært begrensende og uforenlig med konvensjonelle optiske bildesystemer,fluorescens mikroskopi eller ikke-lineær mikroskopi. Et annet punkt som vi kan nevne her er at kvantitativ måleevne er fortsatt ganske begrenset og er avhengig av tilgjengeligheten av matrix-matchet laboratoriestandarder. Den videre generalisering av bruk av elementær mikroanalyse i industriprosesser, geologi, biologi og andre domener av søknader vil generere betydelige konseptuelle og teknologiske gjennombrudd.

Hensikten med den foreliggende manuskriptet er å foreslå løsninger for kvantitativ elementært kartlegging (eller elementær mikroanalyse) i biologiske vev med en bordplate instrumentering fullstendig kompatibel med konvensjonelle optiske mikroskopi. Vår tilnærming er basert på laser-indusert sammenbrudd spektroskopi (LIBS teknologi). I LIBS, en laserpuls fokusert på prøven av interesse å skape nedbryting og tenn av materialet. Atom strålingen som sendes ut i plasma blir deretter analysert ved hjelp av et spektrometer, og de elemental konsentrasjoner kan hentes med målinger kalibrering utført på forhånd ^13,14. Fordelene med LIBS omfatter følsomhet (ug / g for nesten alle de elementer), kompakthet, meget enkel prøvepreparering, fraværet av kontakt med prøven, øyeblikkelig reaksjon og presist lokalisert (mikro) overflate analyse. Imidlertid fortsatt anvendelse av vev kjemisk avbildning utfordrende siden laseren ablasjon av vevet må være fint styrt for å utføre kart med høy romlig oppløsning sammen med følsomhet i ug / g område ^15,16.

Med en slik løsning, er det adjunction av sporstoff eller merking agenter ikke nødvendig, som kan oppdage uorganiske elementer direkte i sitt opprinnelige miljø i biologiske vev. Den LIBS instrument utviklet i vårt laboratorium har en aktuell oppløsning dårligere enn 100 pm med en beregnet følsomhet for Gd under 35 ug / g, tilsvarende 0,1 mM ^16, som gjør det muligkartlegging av store prøver (> 1 cm ²⁾ i løpet av 30 min. I tillegg forenkler hjemmelaget programvare anskaffelse og utnyttelse av dataene. Dette instrument blir brukt til å detektere, kart og kvantifisere vevsdistribusjon av gadolinium (Gd) baserte nanopartikler ^17-18 i nyrene og tumorprøver fra små dyr, 1 til 24 timer etter intravenøs injeksjon av partikler (størrelse <5 nm) . Uorganiske elementer, som er egentlig inneholdt i et biologisk vev, slik som Fe, Ca, Na, og P, er også blitt detektert og fotografert.

Protocol

En. Biologisk Prøvepreparering Alle forsøkene som er beskrevet i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved CECCAPP (Lyon, Frankrike) (autorisasjon # LYONSUD_2012_004), og forsøkene ble utført under oppsyn av autoriserte personer (L. Sancey, DDPP autorisasjon # 38 05 32). Legg en ml av H 2 O til 100 mikromol gadolinium (Gd)-baserte nanopartikler, vente 15 min, og legg 20 mL av HEPES 50 mm, NaCl 1.325 M, CaCl 2 20 mm til…

Representative Results

Som vist i figur 1, er strålen av en Nd: YAG laser i den fundamentale bølgelengde på 1064 nm var fokusert vertikalt ned på vevet stykke av en kvartslinse på 50 mm brennvidde. Den pulsenergi var 4 mJ og repetisjonsfrekvensen 10 Hz. For å unngå generering av plasma i luft, ble laserstrålen fokusert rundt 100 mikrometer under overflaten av prøven. Ingen luft plasma ble observert i denne tilstanden. Under eksperimentene ble prøven beveges av en trinnmotor for å generere en plasma i én posisjon p…

Discussion

Anvendt til biologisk prøve, kan denne teknikken kjemisk bildebehandling, dvs. kartlegging og kvantifisering, Gd og Si fra injisert Gd-baserte nanopartikler i forskjellige organer. Fra de viktigste kritiske innstillinger, er kontroll av laser egenskaper (bølgelengde, pulsenergi, fokus, og stabilitets) kritisk for en nøyaktig og fin vev ablasjon (dvs. mapping oppløsning), så vel som for sensitivitet. Jobber på høy energi gir en bedre følsomhet, men dessverre genererer degradert romlig oppløsnin…

Materials

Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 ns temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
mice	Charles River	depending of animal breeding
isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia – Isofluranum
isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
liquide nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample