In vitro kultur systemer har vist sig uundværlig for vores forståelse af hvirveldyr myogenese. Dog stadig meget at lære om nonmammalian skeletmuskulatur udvikling og vækst, især i basal taxa. En effektiv og robust protokol for at isolere voksne stamceller i dette væv, de myogene præcursorceller (MPL), og opretholdelse af deres selv-fornyelse, proliferation og differentiering i en primær kultur indstilling giver mulighed for at identificere bevarede og divergerende reguleringsmekanismer hele slægter hvirveldyr.
På grund af den iboende vanskelighed og tid, der med at studere den myogene program in vivo dyrkningssystemer primære afledt fra de bosiddende voksne stamceller skeletmuskulatur, de myogene præcursorceller (MPCs), har vist sig uundværlig for vores forståelse af pattedyr skeletmuskulatur udvikling og vækst. Især blandt den basale systematiske enheder af Hvirveldyr dog data er begrænsede, der beskriver de molekylære mekanismer, der styrer den selv-fornyelse, proliferation og differentiering af Middelhavspartnerlandene. Af særlig interesse er potentielle mekanismer der ligger til grund evne basal hvirveldyr at gennemgå betydelig postlarval skelet myofiber hyperplasi (dvs. benfisk) og fuldt regeneration efter vedhæng tab (dvs. halepadder padder). Derudover kan anvendelsen af dyrkede myoblaster støtte i forståelsen af regenerering og reprisen af myogenic program og forskellene mellem dem. Tildette formål har vi beskriver i detaljer, en robust og effektiv protokol (og variationer deri) til isolering og vedligeholdelse af Middelhavspartnerlandene og deres afkom, myoblaster og umodne myorør i cellekultur som en platform for at forstå udviklingen af myogenic program, begyndende med mere basale hvirveldyr. Udnytte modelorganismen status zebrafisk (Danio rerio), rapporterer vi om anvendelsen af denne protokol til små fisk af karpefisk clade Danioninae. I tandem, kan denne protokol udnyttes til at realisere en bredere komparativ tilgang ved at isolere Middelhavspartnerlandene fra den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum) og endda gnavere. Denne protokol er nu almindeligt anvendt i at studere myogenese i flere fiskearter, herunder regnbueørred, laks, og guldbrasen 1-4.
Betydelig forståelse af pattedyr myogenese er opnået gennem sammenfatning af denne proces i både primær mus (Mus musculus) myoblast kulturer og velbeskrevet muse-cellelinie, C2C12 5.. Begyndende i 1950'erne 6, har disse kulturer ført til megen fremgang i forståelsen af murinemyogenic program og i forlængelse heraf myogenese i andre hvirveldyr. Derudover har encellede myofiber eksplantation teknikker steget ud forståelse af samspillet mellem satellit celler og omkringliggende myofibre 7-9. Cellekulturer særligt attraktivt for undersøgelser af myogenese grund af den korte tid fra forløber for differentieret celle 10, relativt lette transfektion for RNAi 11-14 transgene 15,16 og overekspression undersøgelser 14,17,18 in vitro ekspansion efterfulgt af in vivo-transplantation 18-20, og endda compArison af myogene prækursorceller og deres regulerende agenter over taxa 21,22. Mens forskelle på grund af den kunstige miljø af kulturen systemet er blevet beskrevet 5,23, har disse in vitro systemer vist sig at være uundværlig for vores dissektion af de indviklede program regulerer dannelsen af flercellede, terminalt differentieret myofibersfrom mononukleære proliferative stamceller kendt som myosatellite celler (MSC) blandt pattedyr.
Uden for klassen Mammalia dog bevarelse og / eller divergens af mekanismer, der styrer myogenese er dårligt forstået, hovedsagelig på grund af vanskeligheden ved dyrkning myogene prækursorceller (MPCs) og myoblaster fra forskellige taxa. Faktisk har primære myoblast kulturer kun blevet beskrevet i tre fugle 24-26, et krybdyr 27, et par padder 28-30, og nogle fisk 1,3,4,31-33. Kontinuerlig myogene cellelinjer fra veandre end gnavere 34-36 rtebrates er endnu mere sjældent, med den eneste ikke-pattedyr myogene cellelinie er afledt af japansk vagtel (Cortunix japonica), QM7 37. Trods mange forsøg på immortalisering, en teleost myogenic cellelinie fortsat undvigende og en protokol til effektiv transfektion af disse celler blev først offentliggjort i år 15. Således er klare og godt optimeret protokoller for dyrkning af primære Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra en række af hvirveldyr meget nødvendig for at ikke blot yderligere udvide vores viden om udviklingen af myogenic program, men at ansætte magt sammenlignende fysiologi at gøre gennembrud i behandling af humane skeletmuskel sygdomme og lidelser.
Mens litteraturen indeholder mange rapporter om MPC / myoblast isolation 38-49, er det almindeligt for forfattere til at beskrive protokoller for sådanne isolationer i korte, ofte ufuldstændige, formater. Endvidere er de mest lærerige protokoller reported er udviklet til mus 50-53, og nogle af disse er afhængige af Antibody Selection 54,55 eller fluorescens transgener 56,57, hvilket gør disse protokoller ubrugelige eller upraktiske inderste ikke-gnavere udnyttet af muskel biologer. Med lidt kendt om piscine, padder og krybdyr myogenese, en detaljeret og grundig protokol, der er beskrevet med audiovisuelle vejledning og med demonstreret effektivitet i fjernt beslægtede arter ville være mest nyttigt til feltet.
Først beskrevet af Powell og kolleger i 1989 58 blev følgende protokol oprindeligt udviklet til at isolere Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra laksefisk fisk (nemlig regnbueørred, Oncorhynchus mykiss, og atlanterhavslaks, Salmo salar) og nogle større karpefisk (dvs. guldfisk, Carassiusauratusauratus) . I 2000 Fauconneau og Paboeuf optimeret en primær myoblast kultur for regnbueørred 59, og minoroptimizations made denne protokol anvendelige i flere mindre minnows af Danioninae clade (zebrafisk, Danio rerio, og kæmpe danio, Devario aequipinnatus) 32 på grund af de mange genetiske værktøjer til rådighed for zebrafisk arbejde og dermed dens nære slægtninge. Benfisk er attraktive organismer til undersøgelse på grund af deres afvigende vækststrategi (i hvert fald i de fleste arter). Store laksefisk, ligesom de fleste fisk, vokser tidsubegrænset, med vækstpotentiale uhindret af en asymptote ved udløb, selv i alderdommen 60-62. I modsætning til zebrafisk, store danionins såsom kæmpe danio 63 og moustached Danio display vækstpotentialer typiske for benfisk, hvilket gør deres direkte sammenstilling en ideel platform for forståelse om MPC celle skæbne valg spiller en rolle i skeletmuskulatur hyperplasi kontra hypertrofi.
Ligeledes har vi vist, at denne protokol kan bruges med mus og axolotls med relativt høje celle udbytte og viaBility indeks. Halepadder salamandre, såsom den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum), besidder den bemærkelsesværdige evne til at regenerere væv, herunder hele lemmer og hale 64-66. Denne egenskab gør disse padder interessante modeller af skeletmuskelsvind og aldring. Anvendelse af protokollen beskrevet nedenfor, kan der foretages en lignende fremgangsmåde som man har gjort i mange fiskearter, der giver en endnu bredere komparativ kontekst for sådanne undersøgelser. Som mange virkelig sammenlignende biologer pris på, de mest meningsfulde fremskridt i grundlæggende biologi og translationel biomedicin kan foretages, når data analyseres inden det bredeste spektrum (her, hele hvirveldyr afstamning).
Den myogene programmet, uanset undersøgte arter kan lettest studeres gennem et in vitro system. Faktisk ved isolation, myogene præcursorceller (MPCs) i fisk eller myosatellite celler (MSC) i pattedyr let ind i denne stærkt regulerede proces, der involverer proliferation, tilbagetrækning cellecyklus, og terminal differentiering af myoblaster og sammensmeltningen af disse myoblaster i spirende myotuber. Den generelle mangel på transgene gen reporter stammer af piscine arter (måske med undtagelse af ze…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne udvide mange tak til Drs. Josep Planas og Juan Castillo for deres professionelle ekspertise inden for udvikling og anvendelse af denne kultur protokol til små fisk og padder. Også tak til de mange personer, der har utrætteligt bistået med dissektion og dissociation af muskelvæv fra mange fisk (både i art og antal), herunder Matthew Opladning, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, og Sinibaldo Romero. Dette arbejde blev støttet af University of Alabama i Birmingham Biologisk Institut startfonde, Center for Protease Research NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 og NDSU Advance FREM NSF Grant # HRD-0.811.239 til PRB. Der blev også leveret af UAB Nutrition Obesity Research Center prisen # P30DK056336, NIH NIDDK. Indholdet er alene forfatternes ansvar og ikke nødvendigvisrepræsenterer de officielle synspunkter NIH.
Table 1. Detailed Reagent Information | ||||
Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture | |
γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L | |
Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g | |
HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g | |
Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL | |
Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL | |
Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL | |
Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL | |
Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g | |
Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g | |
Table 2. Consumables, Tools and Equipment | ||||
Consumable | Tools | Equipment | ||
Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | ||
Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | ||
Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | ||
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | ||
Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | ||
Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | ||
12-16 G Cannulas with Luer Locks | ||||
Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** | |
6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 | |
24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 | |
48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 | |
96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 | |
*0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | |||
Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | ||||
Reagent | Isolation | Wash | Dissociation | Complete |
Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL | 178.00 mL |
PSF* | 5.00 mL | 4.00 mL | 3.00 mL | 2.00 mL |
Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | – | – |
Donor Equine Serum | 75.00 mL | – | – | – |
Fetal Bovine Serum*** | – | – | – | 20.00 mL |
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | ||||
Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume | |
6 well | 9.5 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 1 mL | |
24 well | 1.9 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 250 μL | |
48 well | 0.95 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 150 μL | |
96 well | 0.32 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 50-100 μL | |
Table 6. Average number of cells per g tissue | ||||
Species | Average # cells/g tissue | |||
Danio rerio | 6,400,000 | |||
Danio dangila | 1,783,000 | |||
Devario aequipinnatus | 1,797,000 | |||
Oncorhynchus mykiss | 66,800 | |||
Table 7. Recommended Incubation Temperatures | ||||
Species | Temperature | |||
Danio/ Devario spp. | 26 – 28 °C | |||
Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* – 18 °C | |||
Ambystoma mexicanum | 18°C | |||
* Lower temperatures support lower proliferation rates. |