Fremstilling af primær Myogenic precursorcelle / myoblast kulturer fra Basal hvirveldyr afstamninger

Summary

In vitro kultur systemer har vist sig uundværlig for vores forståelse af hvirveldyr myogenese. Dog stadig meget at lære om nonmammalian skeletmuskulatur udvikling og vækst, især i basal taxa. En effektiv og robust protokol for at isolere voksne stamceller i dette væv, de myogene præcursorceller (MPL), og opretholdelse af deres selv-fornyelse, proliferation og differentiering i en primær kultur indstilling giver mulighed for at identificere bevarede og divergerende reguleringsmekanismer hele slægter hvirveldyr.

Abstract

På grund af den iboende vanskelighed og tid, der med at studere den myogene program in vivo dyrkningssystemer primære afledt fra de bosiddende voksne stamceller skeletmuskulatur, de myogene præcursorceller (MPCs), har vist sig uundværlig for vores forståelse af pattedyr skeletmuskulatur udvikling og vækst. Især blandt den basale systematiske enheder af Hvirveldyr dog data er begrænsede, der beskriver de molekylære mekanismer, der styrer den selv-fornyelse, proliferation og differentiering af Middelhavspartnerlandene. Af særlig interesse er potentielle mekanismer der ligger til grund evne basal hvirveldyr at gennemgå betydelig postlarval skelet myofiber hyperplasi (dvs. benfisk) og fuldt regeneration efter vedhæng tab (dvs. halepadder padder). Derudover kan anvendelsen af ​​dyrkede myoblaster støtte i forståelsen af ​​regenerering og reprisen af ​​myogenic program og forskellene mellem dem. Tildette formål har vi beskriver i detaljer, en robust og effektiv protokol (og variationer deri) til isolering og vedligeholdelse af Middelhavspartnerlandene og deres afkom, myoblaster og umodne myorør i cellekultur som en platform for at forstå udviklingen af ​​myogenic program, begyndende med mere basale hvirveldyr. Udnytte modelorganismen status zebrafisk (Danio rerio), rapporterer vi om anvendelsen af denne protokol til små fisk af karpefisk clade Danioninae. I tandem, kan denne protokol udnyttes til at realisere en bredere komparativ tilgang ved at isolere Middelhavspartnerlandene fra den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum) og endda gnavere. Denne protokol er nu almindeligt anvendt i at studere myogenese i flere fiskearter, herunder regnbueørred, laks, og guldbrasen ^1-4.

Introduction

Betydelig forståelse af pattedyr myogenese er opnået gennem sammenfatning af denne proces i både primær mus (Mus musculus) myoblast kulturer og velbeskrevet muse-cellelinie, C2C12 ^5.. Begyndende i 1950'erne ^6, har disse kulturer ført til megen fremgang i forståelsen af murinemyogenic program og i forlængelse heraf myogenese i andre hvirveldyr. Derudover har encellede myofiber eksplantation teknikker steget ud forståelse af samspillet mellem satellit celler og omkringliggende myofibre ^7-9. Cellekulturer særligt attraktivt for undersøgelser af myogenese grund af den korte tid fra forløber for differentieret celle ^10, relativt lette transfektion for RNAi ^11-14 transgene ^15,16 og overekspression undersøgelser ^14,17,18 in vitro ekspansion efterfulgt af in vivo-transplantation ^18-20, og endda compArison af myogene prækursorceller og deres regulerende agenter over taxa ^21,22. Mens forskelle på grund af den kunstige miljø af kulturen systemet er blevet beskrevet ^5,23, har disse in vitro systemer vist sig at være uundværlig for vores dissektion af de indviklede program regulerer dannelsen af flercellede, terminalt differentieret myofibersfrom mononukleære proliferative stamceller kendt som myosatellite celler (MSC) blandt pattedyr.

Uden for klassen Mammalia dog bevarelse og / eller divergens af mekanismer, der styrer myogenese er dårligt forstået, hovedsagelig på grund af vanskeligheden ved dyrkning myogene prækursorceller (MPCs) og myoblaster fra forskellige taxa. Faktisk har primære myoblast kulturer kun blevet beskrevet i tre fugle ^24-26, et krybdyr ^27, et par padder ^28-30, og nogle fisk ^1,3,4,31-33. Kontinuerlig myogene cellelinjer fra veandre end gnavere ^34-36 rtebrates er endnu mere sjældent, med den eneste ikke-pattedyr myogene cellelinie er afledt af japansk vagtel (Cortunix japonica), QM7 ^37. Trods mange forsøg på immortalisering, en teleost myogenic cellelinie fortsat undvigende og en protokol til effektiv transfektion af disse celler blev først offentliggjort i år ^15. Således er klare og godt optimeret protokoller for dyrkning af primære Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra en række af hvirveldyr meget nødvendig for at ikke blot yderligere udvide vores viden om udviklingen af ​​myogenic program, men at ansætte magt sammenlignende fysiologi at gøre gennembrud i behandling af humane skeletmuskel sygdomme og lidelser.

Mens litteraturen indeholder mange rapporter om MPC / myoblast isolation ^38-49, er det almindeligt for forfattere til at beskrive protokoller for sådanne isolationer i korte, ofte ufuldstændige, formater. Endvidere er de mest lærerige protokoller reported er udviklet til mus ^50-53, og nogle af disse er afhængige af Antibody Selection ^54,55 eller fluorescens transgener ^56,57, hvilket gør disse protokoller ubrugelige eller upraktiske inderste ikke-gnavere udnyttet af muskel biologer. Med lidt kendt om piscine, padder og krybdyr myogenese, en detaljeret og grundig protokol, der er beskrevet med audiovisuelle vejledning og med demonstreret effektivitet i fjernt beslægtede arter ville være mest nyttigt til feltet.

Først beskrevet af Powell og kolleger i 1989 ⁵⁸ blev følgende protokol oprindeligt udviklet til at isolere Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra laksefisk fisk (nemlig regnbueørred, Oncorhynchus mykiss, og atlanterhavslaks, Salmo salar) og nogle større karpefisk (dvs. guldfisk, Carassiusauratusauratus) . I 2000 Fauconneau og Paboeuf optimeret en primær myoblast kultur for regnbueørred ^59, og minoroptimizations made denne protokol anvendelige i flere mindre minnows af Danioninae clade (zebrafisk, Danio rerio, og kæmpe danio, Devario aequipinnatus) ³² på grund af de mange genetiske værktøjer til rådighed for zebrafisk arbejde og dermed dens nære slægtninge. Benfisk er attraktive organismer til undersøgelse på grund af deres afvigende vækststrategi (i hvert fald i de fleste arter). Store laksefisk, ligesom de fleste fisk, vokser tidsubegrænset, med vækstpotentiale uhindret af en asymptote ved udløb, selv i alderdommen ^60-62. I modsætning til zebrafisk, store danionins såsom kæmpe danio ⁶³ og moustached Danio display vækstpotentialer typiske for benfisk, hvilket gør deres direkte sammenstilling en ideel platform for forståelse om MPC celle skæbne valg spiller en rolle i skeletmuskulatur hyperplasi kontra hypertrofi.

Ligeledes har vi vist, at denne protokol kan bruges med mus og axolotls med relativt høje celle udbytte og viaBility indeks. Halepadder salamandre, såsom den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum), besidder den bemærkelsesværdige evne til at regenerere væv, herunder hele lemmer og hale ^64-66. Denne egenskab gør disse padder interessante modeller af skeletmuskelsvind og aldring. Anvendelse af protokollen beskrevet nedenfor, kan der foretages en lignende fremgangsmåde som man har gjort i mange fiskearter, der giver en endnu bredere komparativ kontekst for sådanne undersøgelser. Som mange virkelig sammenlignende biologer pris på, de mest meningsfulde fremskridt i grundlæggende biologi og translationel biomedicin kan foretages, når data analyseres inden det bredeste spektrum (her, hele hvirveldyr afstamning).

Protocol

Etik Statement: Alle forsøg med hvirveldyr, der er beskrevet heri, blev godkendt på forhånd af Institutional Animal Care og brug Udvalg for University of Alabama i Birmingham og er i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health i USA Institut for Sundhed og Human Services. 1.. Til kultur Forbered basismediet som følger: 9 mM NaHCO3 (1,51 g pr 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g pr 2 L) i DMEM (13,4…

Representative Results

Fireogtyve timer efter såning, myogene præcursorceller (MPCs) skal være synlig fastgjort til laminin substrat (se figur 1a og 1d). Efter såning, celler (MPCs) vedtage en spindel-lignende form, indikerer denne celletype (figur 1) og er MYOD1 + (Figur 2). I Danio arter, Middelhavspartnerlandene synes at være mere kompakt med mindre bipolære processer end at gøre Middelhavspartnerlandene fra Oncorhynchus og Salmo arter. Me…

Discussion

Den myogene programmet, uanset undersøgte arter kan lettest studeres gennem et in vitro system. Faktisk ved isolation, myogene præcursorceller (MPCs) i fisk eller myosatellite celler (MSC) i pattedyr let ind i denne stærkt regulerede proces, der involverer proliferation, tilbagetrækning cellecyklus, og terminal differentiering af myoblaster og sammensmeltningen af ​​disse myoblaster i spirende myotuber. Den generelle mangel på transgene gen reporter stammer af piscine arter (måske med undtagelse af ze…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.