Method Article

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

DOI:

10.3791/51354

April 30th, 2014

In This Article

Summary

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La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l'identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.

Abstract

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A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l'utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l'evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l'applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.

Introduction

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Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le ind....

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Protocol

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Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani.

1. Preparazione per la Cultura

  1. Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13,48 g / L; 26,96 g per 2 L).
    1. Determinare il pH e regolare a 7,40 con HCl o NaOH.

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Results

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Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavia.......

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Discussion

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Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull'isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie p.......

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Disclosures

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Non c'è nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l'applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biolo....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tabella 1. Informazioni dettagliate sui reagenti
reagenti(preferito vs. alternativo)Numero di catalogo (preferito v. alternativo)Quantità per coltura
γ-irradiato poli-L-lisinaSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (glucosio alto)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LamininBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
di bicarbonato di sodio (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1,51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9,53 g
Antibiotico/AntimicoticoThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 ml di
gentamicina solfatoLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
Sieri equini donatoriThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
Sieri fetali boviniThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
Collagenasi (Tipo IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0,44 g
Tripsina (dal pancreas)MP Biomedicali (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tabella 2. Materiali di consumo, strumenti e attrezzature
Strumenti di consumoAttrezzature
Piastre per colture cellulariPinze (grossolane)Pipettatore
Sterile Provette coniche da 50 mLPinze (fini)Misuratore di
Nastro da laboratorioManici per bisturi Incubatoredi raffreddamento (Echotherm)
0,2 μ m Sistemi di sterilizzazione sottovuotoLame per bisturi (#10, #11)Cappa
laminare Autoclave idrorepellenteForbici chirurgicheCollettore
Pipette sierologiche Piastredi Petri in vetroMisuratore
12-16 G Cannule con Luer Locks
Tabella 3. Volumi ottimizzati per il rivestimento di piastre per colture cellulari
Dimensioni della piastracm^2 per pozzettoPoli-L-lisina*Laminina**
6 pozzetti9,51,6 mL1
24 pozzetti1,90,320,2 48
pozzetti0,950,160,1
96 pozzetti0,320,060,03
*0,1 mg/mL concentrazione** 0,020 mg/mL concentrazione
Tabella 4. Terreni per l'isolamento, la dissociazione e la coltura
ReagenteIsolamento LavaggioDissociazione
Base Terreno419,25 mL395,40 mL297,00 mL
Gentamicina solfato**0,75 mL0,60 mL-Siero
equino donatore75,00 mL--
Siero fetale bovino***---
* PSF: cocktail di penicillina/streptomicina/fungizone (100x); ** Concentrazione di 50 mg/mL; Caratterizzato
Tabella 5. Diluizioni e volumi di placcatura consigliati
Dimensione della piastracm^2 per pozzettodi diluizione della placcatura
6 pozzetti9,51,5-2,0x10^6 cellule/mL1 mL
24 pozzetti1,91,5-2,0x10^6 cellule/mL250 μ L
48 pozzetti0,951,5-2,0x10^6 cellule/mL150 μ L
96 pozzetti0,321,5-2,0x10^6 cellule/mL50-100 μ L
Tabella 6. Numero medio di cellule per g di tessuto
SpecieMedia # cellule/g di tessuto
Danio rerio6.400.000
Danio dangila1.783.000
Devario aequipinnatus1.797.000
Oncorhynchus mykiss66.800
Tabella 7. Temperature di incubazione consigliate
Temperaturadella specie
Danio/ Devario spp.26 - 28 gradi C
Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 gradi C
Ambystoma mexicanum18° C
* Temperature più basse favoriscono tassi di proliferazione più bassi.
Azienda disierologicopHa flusso di carta a vuoto di microosmolalità Volume

References

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  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J.

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