Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

Summary

В пробирке культуры системы оказались незаменимым для понимания позвоночных миогенеза. Однако многое еще предстоит узнать о nonmammalian развития скелетных мышц и роста, особенно в базальных таксонов. Эффективный и надежный протокол для выделения взрослых стволовых клеток этой ткани, миогенных клеток-предшественников (ПДК), и поддержание их самообновление, пролиферацию и дифференциацию в первичной настройке культуры позволяет для идентификации консервативных и расходящихся регуляторных механизмов на протяжении позвоночные линий.

Abstract

Из-за присущего сложности и времени, с изучением миогенную программу в естественных условиях, основные системы культуры, полученные из резидентов взрослых стволовых клеток скелетных мышц, миогенных клетки-предшественники (ПДК), доказали, незаменимым для понимания млекопитающих развития скелетных мышц и рост. Особенно среди базальных таксонов позвоночных, однако, данные ограничены описания молекулярных механизмов, контролирующих самообновление, пролиферацию и дифференцировку ПДК. Особый интерес представляют возможные механизмы, лежащие в основе способности базальных позвоночных пройти значительное постларвальных скелетных мышечное волокно гиперплазии (т.е. костистых рыб) и полный регенерации следующие придаток потери (т.е. urodele земноводных). Кроме того, использование культивируемых миобластов может помочь в понимании регенерации и обобщенная информация о миогенного программы и различия между ними. КС этой целью мы подробно надежную и эффективный протокол (и вариации в нем) для выделения и поддержания ПДК и их потомство, миобластов и незрелых мышечных трубках, в культуре клеток в качестве платформы для понимания эволюции миогенной программы, начиная с более базальные позвоночных. Капитализация на модели статуса организма от рыбок данио (Danio рерио), мы сообщаем о применении настоящего Протокола на небольших рыб карповых клады Danioninae. В тандеме, этот протокол может быть использован для реализации более широкого сравнительного подхода, изолируя ПДК от мексиканской аксолотля (Ambystomamexicanum) и даже лабораторных грызунов. Этот протокол в настоящее время широко используются при изучении миогенез в нескольких видов рыб, в том числе, радужной форели, лосося и морского леща ^1-4.

Introduction

Значительное понимание миогенеза млекопитающих была получена через репризе этого процесса в обоих первичного мышь (Mus Musculus) миобластов культур и хорошо описанной мыши происхождения клеточной линии, C2C12 ^5. Начиная с 1950-х годов ^6, эти культуры привели к большому прогрессу в понимании murinemyogenic программы и, как следствие, миогенеза у других позвоночных. Кроме того, одной клетки методы миофибрилл эксплантов увеличились из понимания взаимодействий между сателлитных клеток и окружающих мышечных волокон ^7-9. Культуры клеток особенно привлекательным для исследований миогенеза из-за короткого времени предшественника к дифференцированному ячейки ^10, относительной легкости трансфекции для РНК-интерференции ^11-14, трансгенные ^15,16 и избыточная экспрессия исследования ^14,17,18, расширение в пробирке с последующей трансплантацией в естественных условиях ^18-20, и даже получения оценочногоАрисон миогенных клеток-предшественников и их агентов регулирующих всей таксонов ^21,22. В то время как различия, связанные с искусственной среде системе культуры были описаны ^5,23, системы эти в пробирке оказались незаменимым в нашей рассечения сложной программы, регулирующей формирование многоядерные, терминально дифференцированных myofibersfrom Мононуклеированные пролиферативные клетки-предшественники, известные как myosatellite клетки (МСК) среди млекопитающих.

Вне классу млекопитающих, однако, сохранение и / или расхождение механизмов, контролирующих миогенез плохо изучены, в основном из-за трудностей в культивировании миогенные клетки-предшественники (ПДК) и миобластов из различных таксонов. В самом деле, первичные миобластов культуры описаны лишь в трех птиц ^24-26, одного гада ^27, несколько амфибий ^28-30 и некоторых рыб ^1,3,4,31-33. Непрерывные миогенные клеточные линии от векроме грызунов ^34-36 rtebrates встречаются еще реже, с той лишь не-млекопитающих миогенной клеточной линии были построены на основе японского перепела (Cortunix японская), QM7 ^37. Несмотря на многочисленные попытки увековечения, костистых миогенной клеточная линия остается неуловимым и протокол для эффективной трансфекции этих клеток был только опубликован этот ¹⁵ год. Таким образом, четкие и хорошо оптимизированные протоколы для культивирования первичных ПДК и миобластов из различных позвоночных очень нужны не только дальнейшее расширение наших знаний о эволюции миогенной программы, но использовать силу сравнительной физиологии делать прорывы в лечение скелетных заболеваний и расстройств человека мышц.

В то время как в литературе имеются многочисленные сообщения о изоляции ПДК / миобластов ^38-49, он является общим для авторов описать протоколы для таких выделений в краткой, часто неполные, форматов. Кроме того, наиболее поучительные протоколы репоrted были разработаны для мышей ^50-53, и некоторые из них полагаются на выбор антител ^54,55 или флуоресцентных трансгенов ^56,57, что делает эти протоколы непригодным или непрактичные сокровенные видов не-грызунов, используемые мышечных биологов. С малоизвестный о Piscine, амфибии, рептилии и миогенеза, подробное и тщательное протокола, описанного с аудиовизуальной руководством и при продемонстрировали эффективности в отдаленно родственных видов, будет наиболее полезным для области.

Впервые описан Пауэлл и его коллеги в 1989 году ^58, в следующем протокол изначально был разработан, чтобы изолировать ПДК и миобластов из лососевых рыб (а именно, радужной форели, радужная форель и семга, Salmo Salar) и некоторых крупных рыб семейства карповых (т.е. золотая рыбка, Carassiusauratusauratus) . В 2000 году Fauconneau и Paboeuf оптимизирован первичной культуры миобластов для радужной форели ^59, и minoroptimizations маде этого протокола усвояемой в несколько более мелких пескарей в кладе Danioninae (данио, Danio рерио, и гигантский данио, Devario aequipinnatus) ³² в связи с многочисленными генетических инструментов, доступных для рыбок данио работы и, таким образом его близких родственников. Костистых рыб являются привлекательными организмы для исследования в связи с их расходящихся стратегии роста (по крайней мере у большинства видов). Большие лососевых, как и большинство рыб, растут неопределенно, с потенциалом роста свободной от асимптоты в конце срока, даже в пожилом возрасте ^60-62. В отличие от рыбок данио, большие danionins такие как гигантский данио ⁶³ и усатых потенциалов роста данио дисплей типичных костистых рыб, что делает их прямое сопоставление идеальной платформой для понимания, играет ли судьба клеток MPC выбор роль в скелетных мышц гиперплазии против гипертрофии.

Кроме того, мы показали, что этот протокол может быть использован с мышами и аксолотлях, с относительно высоким выходом клеток и viabСОСТОЯНИЯ индексы. Urodele саламандры, такие как мексиканский аксолотля (Ambystomamexicanum), обладают замечательной способностью к регенерации тканей, в том числе целых конечностей и хвостов ^64-66. Эта особенность делает этих земноводных интересные модели скелетной атрофии мышц и старения. Используя протокол, описанный ниже, подобный подход может осуществляться как это было сделано во многих видов рыб, обеспечивая еще более широкий сравнительный контекст для таких исследований. Как и многие действительно сравнительные биологи оценить, наиболее значимые достижения в области фундаментальной биологии и поступательного биомедицины может быть сделано, когда данные анализируются в широком спектре (здесь, весь ветви позвоночных).

Protocol

Заявление по этике: Все эксперименты с участием позвоночных животных, описанных здесь был утвержден заранее в Уходу за животными и использованию комитета университета Алабамы в Бирмингеме на и согласуется с руководящими принципами, установленными Управлением лабораторных животны…

Representative Results

Через двадцать четыре часа после посева, миогенные клетки-предшественники (ПДК) должны быть видны прикреплен к субстрату ламинина (см. фиг.1А и 1D). После посева, клетки (ПДК) принять шпинделя-образную форму, что свидетельствует о этого типа клеток (рис. 1) и MyoD1 + <st…

Discussion

Миогенной программа, в зависимости от того, изученных видов, может быть наиболее легко учился через систему в пробирке. В самом деле, при изоляции, миогенные клетки-предшественники (ПДК) в рыбе или myosatellite клеток (МСК) у млекопитающих легко войти в этот очень регламентированный проце…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.