В пробирке культуры системы оказались незаменимым для понимания позвоночных миогенеза. Однако многое еще предстоит узнать о nonmammalian развития скелетных мышц и роста, особенно в базальных таксонов. Эффективный и надежный протокол для выделения взрослых стволовых клеток этой ткани, миогенных клеток-предшественников (ПДК), и поддержание их самообновление, пролиферацию и дифференциацию в первичной настройке культуры позволяет для идентификации консервативных и расходящихся регуляторных механизмов на протяжении позвоночные линий.
Из-за присущего сложности и времени, с изучением миогенную программу в естественных условиях, основные системы культуры, полученные из резидентов взрослых стволовых клеток скелетных мышц, миогенных клетки-предшественники (ПДК), доказали, незаменимым для понимания млекопитающих развития скелетных мышц и рост. Особенно среди базальных таксонов позвоночных, однако, данные ограничены описания молекулярных механизмов, контролирующих самообновление, пролиферацию и дифференцировку ПДК. Особый интерес представляют возможные механизмы, лежащие в основе способности базальных позвоночных пройти значительное постларвальных скелетных мышечное волокно гиперплазии (т.е. костистых рыб) и полный регенерации следующие придаток потери (т.е. urodele земноводных). Кроме того, использование культивируемых миобластов может помочь в понимании регенерации и обобщенная информация о миогенного программы и различия между ними. КС этой целью мы подробно надежную и эффективный протокол (и вариации в нем) для выделения и поддержания ПДК и их потомство, миобластов и незрелых мышечных трубках, в культуре клеток в качестве платформы для понимания эволюции миогенной программы, начиная с более базальные позвоночных. Капитализация на модели статуса организма от рыбок данио (Danio рерио), мы сообщаем о применении настоящего Протокола на небольших рыб карповых клады Danioninae. В тандеме, этот протокол может быть использован для реализации более широкого сравнительного подхода, изолируя ПДК от мексиканской аксолотля (Ambystomamexicanum) и даже лабораторных грызунов. Этот протокол в настоящее время широко используются при изучении миогенез в нескольких видов рыб, в том числе, радужной форели, лосося и морского леща 1-4.
Значительное понимание миогенеза млекопитающих была получена через репризе этого процесса в обоих первичного мышь (Mus Musculus) миобластов культур и хорошо описанной мыши происхождения клеточной линии, C2C12 5. Начиная с 1950-х годов 6, эти культуры привели к большому прогрессу в понимании murinemyogenic программы и, как следствие, миогенеза у других позвоночных. Кроме того, одной клетки методы миофибрилл эксплантов увеличились из понимания взаимодействий между сателлитных клеток и окружающих мышечных волокон 7-9. Культуры клеток особенно привлекательным для исследований миогенеза из-за короткого времени предшественника к дифференцированному ячейки 10, относительной легкости трансфекции для РНК-интерференции 11-14, трансгенные 15,16 и избыточная экспрессия исследования 14,17,18, расширение в пробирке с последующей трансплантацией в естественных условиях 18-20, и даже получения оценочногоАрисон миогенных клеток-предшественников и их агентов регулирующих всей таксонов 21,22. В то время как различия, связанные с искусственной среде системе культуры были описаны 5,23, системы эти в пробирке оказались незаменимым в нашей рассечения сложной программы, регулирующей формирование многоядерные, терминально дифференцированных myofibersfrom Мононуклеированные пролиферативные клетки-предшественники, известные как myosatellite клетки (МСК) среди млекопитающих.
Вне классу млекопитающих, однако, сохранение и / или расхождение механизмов, контролирующих миогенез плохо изучены, в основном из-за трудностей в культивировании миогенные клетки-предшественники (ПДК) и миобластов из различных таксонов. В самом деле, первичные миобластов культуры описаны лишь в трех птиц 24-26, одного гада 27, несколько амфибий 28-30 и некоторых рыб 1,3,4,31-33. Непрерывные миогенные клеточные линии от векроме грызунов 34-36 rtebrates встречаются еще реже, с той лишь не-млекопитающих миогенной клеточной линии были построены на основе японского перепела (Cortunix японская), QM7 37. Несмотря на многочисленные попытки увековечения, костистых миогенной клеточная линия остается неуловимым и протокол для эффективной трансфекции этих клеток был только опубликован этот 15 год. Таким образом, четкие и хорошо оптимизированные протоколы для культивирования первичных ПДК и миобластов из различных позвоночных очень нужны не только дальнейшее расширение наших знаний о эволюции миогенной программы, но использовать силу сравнительной физиологии делать прорывы в лечение скелетных заболеваний и расстройств человека мышц.
В то время как в литературе имеются многочисленные сообщения о изоляции ПДК / миобластов 38-49, он является общим для авторов описать протоколы для таких выделений в краткой, часто неполные, форматов. Кроме того, наиболее поучительные протоколы репоrted были разработаны для мышей 50-53, и некоторые из них полагаются на выбор антител 54,55 или флуоресцентных трансгенов 56,57, что делает эти протоколы непригодным или непрактичные сокровенные видов не-грызунов, используемые мышечных биологов. С малоизвестный о Piscine, амфибии, рептилии и миогенеза, подробное и тщательное протокола, описанного с аудиовизуальной руководством и при продемонстрировали эффективности в отдаленно родственных видов, будет наиболее полезным для области.
Впервые описан Пауэлл и его коллеги в 1989 году 58, в следующем протокол изначально был разработан, чтобы изолировать ПДК и миобластов из лососевых рыб (а именно, радужной форели, радужная форель и семга, Salmo Salar) и некоторых крупных рыб семейства карповых (т.е. золотая рыбка, Carassiusauratusauratus) . В 2000 году Fauconneau и Paboeuf оптимизирован первичной культуры миобластов для радужной форели 59, и minoroptimizations маде этого протокола усвояемой в несколько более мелких пескарей в кладе Danioninae (данио, Danio рерио, и гигантский данио, Devario aequipinnatus) 32 в связи с многочисленными генетических инструментов, доступных для рыбок данио работы и, таким образом его близких родственников. Костистых рыб являются привлекательными организмы для исследования в связи с их расходящихся стратегии роста (по крайней мере у большинства видов). Большие лососевых, как и большинство рыб, растут неопределенно, с потенциалом роста свободной от асимптоты в конце срока, даже в пожилом возрасте 60-62. В отличие от рыбок данио, большие danionins такие как гигантский данио 63 и усатых потенциалов роста данио дисплей типичных костистых рыб, что делает их прямое сопоставление идеальной платформой для понимания, играет ли судьба клеток MPC выбор роль в скелетных мышц гиперплазии против гипертрофии.
Кроме того, мы показали, что этот протокол может быть использован с мышами и аксолотлях, с относительно высоким выходом клеток и viabСОСТОЯНИЯ индексы. Urodele саламандры, такие как мексиканский аксолотля (Ambystomamexicanum), обладают замечательной способностью к регенерации тканей, в том числе целых конечностей и хвостов 64-66. Эта особенность делает этих земноводных интересные модели скелетной атрофии мышц и старения. Используя протокол, описанный ниже, подобный подход может осуществляться как это было сделано во многих видов рыб, обеспечивая еще более широкий сравнительный контекст для таких исследований. Как и многие действительно сравнительные биологи оценить, наиболее значимые достижения в области фундаментальной биологии и поступательного биомедицины может быть сделано, когда данные анализируются в широком спектре (здесь, весь ветви позвоночных).
Миогенной программа, в зависимости от того, изученных видов, может быть наиболее легко учился через систему в пробирке. В самом деле, при изоляции, миогенные клетки-предшественники (ПДК) в рыбе или myosatellite клеток (МСК) у млекопитающих легко войти в этот очень регламентированный проце…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить большое спасибо д-ра. Хосеп Планас и Хуан Кастильо для их профессионального опыта в области разработки и применения этого протокола культуры малых рыб и амфибий. Мы также выражаем благодарность к огромного числа людей, которые неустанно помощь при вскрытии и диссоциации мышечной ткани от многих рыб (как в видов и количество), в том числе Мэтью зарядки, Delci Кристенсен, Захари Фаулер, Брук Францен, Натан Froehlich, Кира Маршалл, Бен Мейер, Этан Remily и Sinibaldo Ромеро. Эта работа была поддержана Университета Алабамы в Бирмингеме кафедры биологии стартовые средства, Центр протеазы Исследование NIH Грант # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Грант # R03AR055350 и NDSU продвижении вперед NSF Grant # HRD-0811239 для PRB. Была также оказана поддержка по UAB Питание Ожирение Research Center награда # P30DK056336, NIH NIDDK. Его содержание несут исключительно из авторов и не обязательнопредставляют официальную точку зрения NIH.
Table 1. Detailed Reagent Information | ||||
Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture | |
γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L | |
Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g | |
HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g | |
Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL | |
Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL | |
Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL | |
Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL | |
Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g | |
Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g | |
Table 2. Consumables, Tools and Equipment | ||||
Consumable | Tools | Equipment | ||
Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | ||
Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | ||
Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | ||
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | ||
Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | ||
Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | ||
12-16 G Cannulas with Luer Locks | ||||
Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** | |
6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 | |
24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 | |
48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 | |
96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 | |
*0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | |||
Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | ||||
Reagent | Isolation | Wash | Dissociation | Complete |
Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL | 178.00 mL |
PSF* | 5.00 mL | 4.00 mL | 3.00 mL | 2.00 mL |
Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | – | – |
Donor Equine Serum | 75.00 mL | – | – | – |
Fetal Bovine Serum*** | – | – | – | 20.00 mL |
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | ||||
Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume | |
6 well | 9.5 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 1 mL | |
24 well | 1.9 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 250 μL | |
48 well | 0.95 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 150 μL | |
96 well | 0.32 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 50-100 μL | |
Table 6. Average number of cells per g tissue | ||||
Species | Average # cells/g tissue | |||
Danio rerio | 6,400,000 | |||
Danio dangila | 1,783,000 | |||
Devario aequipinnatus | 1,797,000 | |||
Oncorhynchus mykiss | 66,800 | |||
Table 7. Recommended Incubation Temperatures | ||||
Species | Temperature | |||
Danio/ Devario spp. | 26 – 28 °C | |||
Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* – 18 °C | |||
Ambystoma mexicanum | 18°C | |||
* Lower temperatures support lower proliferation rates. |