Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.
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Articolo metodologico
Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Testare il destino di cellule staminali derivati embrionali o pluripotenti nei protocolli in vitro ha portato a risultati controversi che non riflettono necessariamente la loro potenziale vivo. Preferibilmente, queste cellule devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato al fine di acquisire il loro fenotipo definito. Inoltre, linea cellulare tracciando studi nel topo dopo etichettatura cellule con coloranti o vettori retrovirali è rimasto per lo più limitato alle fasi iniziali embrioni di topo con gli organi ancora poco sviluppati. Per superare queste limitazioni, abbiamo progettato i protocolli microiniezione standard e ultrasuoni-mediata per iniettare vari agenti in regioni mirate di cuore in embrioni di topo a E9.5 e fasi successive di sviluppo. Espianto embrionale o gli embrioni vengono poi coltivate o da sinistra a sviluppare ulteriormente in utero. Questi farmaci comprendono coloranti fluorescenti, virus, shRNAs, o cellule staminali progenitrici di cellule di derivazione. I nostri metodi permettono la conservazione del function dell'organo durante il monitoraggio della migrazione e il destino delle cellule marcate e / o iniettati. Queste tecnologie possono essere estesi ad altri organi e sarà molto utile per affrontare le questioni biologiche fondamentali in biologia dello sviluppo.
Introduzione
Più di un decennio fa, le cellule staminali embrionali umane (HuESCs) sono state derivate da blastocisti umane 1. Da allora, queste cellule sono diventati oggetto di un importante campo di ricerca che affronta le domande insoddisfatte in biologia dello sviluppo umano. HuESCs hanno inoltre fornito speranze nella medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) sono stati generati da cellule somatiche paziente-specifiche, fornendo modelli di malattia genetica 2. Molti protocolli in vitro per la differenziazione delle cellule staminali embrionali pluripotenti indotte o verso varie linee cell....
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Protocollo
1. Preparazione
Procedure sugli animali
Ottenere l'approvazione di un comitato etico animale e seguire le linee guida istituzionali per il lavoro con il virus, HuESC e / o iPSC (se applicabile), così come la gestione del mouse, l'ottenimento di embrioni di topo, ed eseguire un intervento chirurgico mouse. Per accoppiamenti temporizzati, il giorno della spina è considerato giorno embrionale (E) 0,5 / 0,5 giorni dopo coitum.
- Aghi microiniezione:
Per gli ex utero microiniezione, tirare pipette di vetro (tubi di diametro borosilicato capillari esterni 1,2 millimetri) con un estra....
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Risultati
Utilizzando i protocolli di iniezione sopra descritti, le cellule possono essere etichettati e / o iniettati nel cuore embrionale mouse. Come prova di concetto, alcuni esempi sono riportati in cui il protocollo di iniezione e la ex vivo AVC espianto, isolato cuore, o tutta la cultura embrioni sono stati combinati (Figura 1).
La Figura 1 mostra la preparazione dell'embrione prima dell'iniezione delle cellule. L'embrione E9.5 viene estratt.......
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Discussione
I protocolli intra-cardiaca ex vivo di iniezione sopra descritti sono stati concepiti per preservare la funzione miocardica per almeno 48 ore in mid-stage (E9.5-E11.5) embrioni di topo. Questi approcci iniezione consentire l'iniezione spazialmente mirato di DNA o cellule. I pochi esempi riportati nelle figure 1-3 forniscono la prova di concetto per delineare ex vivo e in vivo dei meccanismi molecolari dei processi di sviluppo che si svolgono in regioni ristrette cardiaci, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono la Fondazione Leducq (valvola mitrale) e l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR concedere Specistem) per il finanziamento di questa ricerca.
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Materiali
2
Micromanipolatore Eppendorf 5242 VisualSonics per ruotare il tubo di Incubatrice standard 5% CO, 37 ° C di Petri Olio minerale di Lubrificante per occhi
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Configurazioni/Hardware | |||
| Trasduttore a 40 MHz | Microiniettore VisualSonics | MS550S | |
| Microiniettore | VisualSonics | ||
| Eppendorf | 5171 | ||
| Azoto | necessario per pressurizzare l'iniettore | ||
| Sistema di binari | Rotatore | ||
| vetro con gli embrioni all'interno dell'incubatrice | |||
| Stereomicroscopio | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Tubi capillari in borosilicato | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μ m diametro esterno |
| Estrattore per pipette | Sutter | Modello P87 | |
| Aghi per microiniezione | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1,14 mm/53 mm, con 50/35 μ m Punta OD/ID |
| Siringhe Hamilton | |||
| Piastre | 10 cm di diametro | ||
| Sigma | M8410 | ||
| Membrana siliconica | Visualsonics | 4,3 x 4,3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet Un | ||
| agente di depilazione | Nair | ||
| Optixcare | 31779 | ||
| Gel per elettrodi (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Gel per ultrasuoni | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorfina cloridrato) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0,05-0,1 mg/kg in soluzione salina |
| Altro | |||
| Elastomero siliconico | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Petridish di vetro | Fine Science Tools | 60 mm di diametro | |
| Spilli per insetti | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Terreni e reagenti di coltura | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | alto glucosio e 50% siero di ratto |
| M16 medio | Sigma | M7292 | |
| Siero di ratto | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilina/streptomicina | Life Technologies | 15140-12 | |
| ossigeno 40% | Liquido | d'aria necessario per ossigenare il terreno di coltura embrionale | |
| Siero | fetale di vitelloFisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagene di tipo I | BD | 354236 | per rivestire piastre di coltura per l'espianto |
| . Piastre di coltura | Dutcher/Orange | 131020 | |
| Iniettates | |||
| CDCFDA-SE | Sonde Invitrogen/Molecolari | C1165 | 25 mg/ml di DMSO. Conservare a -20 °C. Diluire 1:100-200 in soluzione salina prima dell'uso. |
| Lentivirus che esprime PGK-GFP | ~8E9 unità di trasduzione/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
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Ristampe e permessi
