Isolering och kultur i vuxen mus Cardiomyocytes för cellsignalering och<em> In vitro</em> Hjärthypertrofi
Summary
Vi beskriver en tillförlitlig metod för isolering av vuxen mus hjärtmuskelceller. Protokollet ger ett konsekvent resultat för kulturen i funktionella vuxna cardiomyocytes från olika genetiskt modifierade möss.
Abstract
Teknologiska framsteg har gjort genetiskt modifierade möss, inklusive transgena och gen knockout-möss, ett viktigt verktyg inom många forskningsområden. Vuxna cardiomyocytes är allmänt accepterat som en bra modell för hjärt-cellulär fysiologi och patofysiologi, samt för läkemedels ingripande. Genmodifierade möss utesluter behovet av komplicerade cardiomyocyte infektionsprocesser för att generera den önskade genotypen, som är ineffektiv på grund av kardiomyocyter 'terminal differentiering. Isolering och kultur av hög kvantitet och kvalitet funktionella cardiomyocytes kommer dramatiskt att gynna kardiovaskulär forskning och ge ett viktigt verktyg för cellsignalering transduktion forskning och läkemedelsutveckling. Här beskriver vi en väletablerad metod för isolering av vuxna mus hjärtmuskelceller som kan genomföras med lite träning. Musen hjärtat skärs ut och kanylerades till en isolerad hjärtsystem och efter perfusion med kalciumfritt och hög potassium buffert följt av typ II kollagenasdigestion i Langendorff retrograd perfusion läge. Protokollet ger ett konsekvent resultat för insamling av funktionella vuxen mus cardiomyocytes från en rad olika genetiskt modifierade möss.
Introduction
Cardiomyocytes inte proliferativ. Det finns några förmaks cardiomyocyte cellinjer, som HL-1 och AT-1 celler från mus förmaks tumörer; emellertid finns det inga vuxen ventrikulär cardiomyocyte cellinjer finns tillgängliga för forskning. Primära cellkulturer av vuxna mus cardiomyocytes ger en kraftfull modell för hjärtforskning på cellulär och molekylär nivå. Hitintills har de använts i stor utsträckning för biokemiska, fysiologiska och farmakologiska forskningen 1. Dessutom har den frekventa användningen av genetiskt modifierade möss som krävde effektiva metoder för cardiomyocyte isolering. Ren kultur tillåter förhållanden fri från samverkan med andra organ och den systemiska cirkulationen, exempelvis genom endogena neurohormonala och hormonliknande faktorer 2,3. Däremot kan framgångsrik isolering av hjärtmuskelceller vara utmanande.
Protokollet vi introducerar detta dokument baseras på våra erfarenheter med vuxna råttor cardiomyocytes och den metod som beskrivs av O'Connell et al 4,5. Särskilt under 2007 5, beskrev de detaljerade tekniker från förberedelser buffert till cellodling och funktionell analys. Eftersom mus-myocyter är mycket mottagliga för kontraktur jämfört med de råttkardiomyocyter är de buffertar eller media som används för perfusionen, matsmältning, Ca 2 + tolerans, plätering och kultur i musprotokollet kompletterat med en ospecifik excitation-kontraktion kopplings inhibitor, 2, 3-butandion monoxim (BDM) för att hämma deras spontana kontraktion, därav lönsamheten och avkastningen av stavformade muskelceller förbättras avsevärt. I protokollet införs här, är myocyterna separeras i en hög kalium buffert från det isolerade hjärtat av modifierad Langendorff perfusion med typ II kollagenas. Kollagenas II bryter effektivt ned den intercellulära matrisen och frigör celler. Perfusionslösningen behåller även cellulär metabolism på en låg nivå 6. I additipå, är det isolerade hjärtsystemet från Harvard Apparatus vi använt här väl utformad för exakt temperatur och konstant tryck kontroll 7. Denna metod ger mycket reproducerbara förberedelser och enhetliga populationer av enstaka celltyp, som kan användas i natten kultur för mätning av signalproteiner eller 2-3 dagars kultur för hjärt hypertrofiska analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
För den bästa förberedelsen, de mest kritiska stegen är: 1) omedelbart ansluter musen hjärta till kanylen efter excision; 2) lämplig hjärta perfusion. Observera också att vattenkvalitet, perfusion temperatur, pH buffert, sterilisering, kemisk renhet, och ren, icke-förorenad slangar och kammare är också viktiga faktorer. 18,2 mQ molekylärbiologi-grade H2O rekommenderas för buffert förberedelse. PH-värdet för 200 mM ATP stamlösning bör justeras till 7,2, ett steg som är lätt att missa.
Det är vik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Vi tackar David Sowa för att redigera detta manuskript.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
Riferimenti
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
