Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics
Summary
Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.
Abstract
Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. De huidige platforms verschillende beperkende factoren, zoals arbeidsintensief monster preparaten lage detectiegrenzen, langzame scan snelheden, intensieve methode optimalisatie voor elke metaboliet, en het onvermogen om zowel positief meten en negatief geladen ionen in enkele experimenten. Daarom kon een roman metabolomics protocol metabolomics studies te bevorderen. Amide-gebaseerde hydrofiele chromatografie maakt polaire metabolietanalyse zonder chemische derivatisering. Hoge resolutie MS met behulp van de Q-Exactive (QE-MS) is verbeterd ionenoptiek, verhoogde scansnelheden (256 msec bij een resolutie van 70.000), en heeft de mogelijkheid van het uitvoeren van positieve / negatieve schakelen. Met een koude methanol extractie strategie en koppelen van een amide-kolom met QE-MS maakt robuuste detectie van 168 gerichte polaire metabolieten en duizenden extra functies tegelijk. Dateen verwerking wordt uitgevoerd met in de handel verkrijgbare software uitgevoerd op een zeer efficiënte wijze en onbekende kenmerken geëxtraheerd uit de massaspectra worden opgevraagd in databases.
Introduction
Metabolomics, gedefinieerd als een experiment dat meerdere metabolieten meet tegelijk, heeft een gebied van intense belangstelling geweest. Metabolomics geeft een directe uitlezing van de moleculaire fysiologie en heeft inzicht in ontwikkeling en ziekte zoals kanker 1-4 verstrekt. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) behoren tot de meest gebruikte instrumenten 5-9. NMR name is gebruikt voor flux experimenten omdat zware isotoop gemerkte verbindingen zoals 13C gelabelde metabolieten zijn NMR-actieve 10,11. Echter, deze strategie vereist relatief hoge zuiverheid van het monster en de grote hoeveelheid van het monster, die haar toepassingen in metabolomics beperkt. Ondertussen, gegevens uit NMR moet intensieve analyse en samengestelde toewijzing van complexe NMR spectra moeilijk. GC-MS is op grote schaal gebruikt voor polaire metabolieten en lipide-studies, maar het vluchtige compoun vereistds en daardoor vaak derivatisering van metabolieten, die soms ingewikkelde chemie die tijdrovend zijn en introduceert experimentele noise.
Vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan triple quadrupool massaspectrometrie gebruikt de eerste quadrupool voor het selecteren van de intacte ouder ionen, die vervolgens worden gefragmenteerd in de tweede quadrupool, terwijl de derde quadrupool wordt gebruikt karakteristieke fragmenten of dochter ionen selecteren. Deze methode, waarbij de overgang van ouder ionen specifieke dochter ionen registreert, wordt meervoudige reactie controle (MRM) genoemd. MRM is een zeer gevoelig, specifiek en robuuste methode voor zowel kleine moleculen en eiwitkwantificering 12-15,21. Echter, MRM heeft wel zijn beperkingen. Om een hoge specificiteit te bereiken een MRM methode moet worden gebouwd voor elk metaboliet. Deze methode bestaat uit het identificeren van een bepaald fragment en bijbehorende geoptimaliseerde botsingsenergie, die pre-kennis van de prope vereistrties van de metabolieten van belang, zoals chemische structuur informatie. Daarom, met enkele uitzonderingen waarbij neutrale verlies gemeenschappelijke fragmenten, is het niet mogelijk om onbekende metabolieten identificeren met deze methode.
In de afgelopen jaren hebben een hoge resolutie (HRMS) instrumenten uitgebracht, zoals de LTQ-orbitrap en Exactive serie, de QuanTof en TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan een massa verschaffen verhouding (m / z) van intacte ionen rekening binnen een fout van enkele ppm. Daarom kan een HRMS instrument bediend door het detecteren alle precursorionen (dwz het volledige scan) directe structurele informatie te verkrijgen van de exacte massa en de resulterende elementaire samenstelling van het analyt, en deze informatie kan worden gebruikt om potentiële metabolieten identificeren. Inderdaad kunnen alle informatie over een verbinding worden verkregen met een exacte massa, tot het niveau van structurele isomeren. Ook een volledigscanmethode vereist geen voorkennis van de metabolieten en geen methode optimalisatie nodig. Aangezien alle ionen met m / z vallen in het scanbereik kan worden geanalyseerd HRMS een vrijwel onbeperkte capaciteit in termen van het aantal metabolieten die kunnen worden gekwantificeerd in een enkele run tegenover de MRM methode. HRMS is ook vergelijkbaar met een drievoudige quadrupool MRM kwantitatieve capaciteit vanwege de korte werkcyclus leidt tot een vergelijkbaar aantal gegevenspunten die worden verkregen in een volledige MS scannen. Daarom HRMS biedt een alternatieve benadering voor de kwantitatieve metabolomics. Onlangs is een verbeterde versie van HRMS genoemd Q-Exactive massaspectrometrie (QE-MS) kan in het schakelen tussen positieve en negatieve standen met voldoende snelle cyclustijden in een werkwijze, waarbij het detectiebereik 19 vergroot worden gebruikt. Hier beschrijven we onze metabolomics strategie met behulp van de QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle metaboliet profilering in cellen met dit protocol zijn: 1) het regelen van het groeimedium en zorgvuldige extractie van de cellen; 2) het aanpassen van de LC-methode gebaseerd op methode setup MS om te zorgen voor voldoende (meestal minstens 10) datapunten over een piek voor kwantificering; 3) het doen van een lage massa calibratie voordat u monsters; 4) het injecteren van niet meer dan 5 ml om te voorkomen retentietijd verschuiven en piekverbreding veroorzaakt door water;…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) en Nathaniel Snyder (Universiteit van Pennsylvania) erkennen voor waardevolle discussies over massa calibratie en dataverwerking. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health Award onder nummer R00CA168997. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
Riferimenti
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
