संवेदनशील, बड़े पैमाने पर मात्रात्मक Metabolomics के लिए एक रणनीति
Summary
Metabolite रूपरेखा स्वास्थ्य और रोग में चयापचय के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति किया गया है. ध्रुवता स्विचिंग और एक तेजी से शुल्क साइकिल के साथ उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित सामान्य चरणबद्ध तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग, हम उच्च संवेदनशीलता, सटीकता, और संकल्प के साथ जैविक सामग्री के ध्रुवीय चयापचय संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
Metabolite रूपरेखा स्वास्थ्य और रोग में चयापचय के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति किया गया है. हालांकि, मौजूदा प्लेटफार्मों ऐसे श्रम गहन नमूना तैयारी, कम सीमा का पता लगाने, धीमी स्कैन गति, प्रत्येक metabolite के लिए गहन विधि अनुकूलन, और सकारात्मक दोनों को मापने के लिए अक्षमता और एकल प्रयोगों में नकारात्मक आरोप लगाया आयनों के रूप में विभिन्न सीमित कारकों, है. इसलिए, एक उपन्यास metabolomics प्रोटोकॉल metabolomics अध्ययन अग्रिम सकता है. एमाइड आधारित हाइड्रोफिलिक क्रोमैटोग्राफी किसी भी रासायनिक derivatization बिना ध्रुवीय metabolite विश्लेषण में सक्षम बनाता है. क्यू Exactive (QE एमएस) का उपयोग उच्च संकल्प एमएस, आयन प्रकाशिकी सुधार स्कैन गति (संकल्प 70,000 से कम 256 मिसे) में वृद्धि हुई है, और सकारात्मक / नकारात्मक स्विचिंग बाहर ले जाने की क्षमता है गया है. एक ठंड मेथनॉल निकासी रणनीति का उपयोग करना, और QE-एमएस के साथ एक एमाइड स्तंभ युग्मन एक साथ अतिरिक्त सुविधाओं की 168 लक्षित ध्रुवीय चयापचयों और हजारों की मजबूत पता लगाने में सक्षम बनाता है. Datएक प्रसंस्करण एक बेहद कारगर तरीका में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है, और जन स्पेक्ट्रा से निकाले अज्ञात सुविधाओं डेटाबेस में पूछे जा सकते हैं.
Introduction
एक साथ कई मेटाबोलाइट्स उपाय है कि एक प्रयोग के रूप में परिभाषित किया Metabolomics, गहन रुचि का क्षेत्र रहा है. Metabolomics आण्विक फिजियोलॉजी का एक सीधा readout प्रदान करता है और इस तरह के कैंसर 1-4 के रूप में विकास और रोग में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस) सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपकरणों 5-9 के बीच में हैं. एनएमआर, विशेष रूप से इस तरह के 13 सी लेबल मेटाबोलाइट्स के रूप में भारी आइसोटोप लेबल यौगिकों, क्योंकि प्रवाह प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, 10,11 एनएमआर सक्रिय हैं. हालांकि, इस रणनीति metabolomics में उसके आवेदन की सीमा है, जो अपेक्षाकृत उच्च नमूना पवित्रता और बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता है. इस बीच, एनएमआर से एकत्र आंकड़ों का गहन विश्लेषण और जटिल एनएमआर स्पेक्ट्रा के परिसर असाइनमेंट मुश्किल है की जरूरत है. जीसी एमएस व्यापक रूप से ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह अस्थिर compoun की आवश्यकताडी एस और कभी कभी समय लगता हो सकता है कि जटिल रसायन विज्ञान शामिल है और प्रयोगात्मक शोर जो परिचय मेटाबोलाइट्स की इसलिए अक्सर derivatization,.
तीसरे quadrupole विशेषता टुकड़े या बेटी आयनों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा), तो दूसरा quadrupole में खंडित कर रहे हैं, जो बरकरार माता पिता के आयनों को चुनने के लिए पहली quadrupole का उपयोग करता है. विशिष्ट बेटी आयनों के लिए माता – पिता आयनों से संक्रमण जो रिकॉर्ड इस विधि, एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी (एम आर एम) करार दिया है. एम आर एम छोटे अणु और प्रोटीन quantitation 12-15,21 दोनों के लिए एक बहुत ही संवेदनशील विशिष्ट, और मजबूत विधि है. हालांकि, MRM अपनी सीमाएं हैं. उच्च विशिष्टता प्राप्त करने के लिए एक एम आर एम विधि प्रत्येक metabolite के लिए बनाया जाना चाहिए. इस पद्धति का एक विशिष्ट टुकड़ा की पहचान करने और prope के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है जो अनुकूलित टक्कर ऊर्जा, इसी के होते हैंइस तरह के रासायनिक संरचना जानकारी के रूप में ब्याज की मेटाबोलाइट्स के rties. इसलिए, आम के टुकड़े का तटस्थ नुकसान शामिल कुछ अपवादों के साथ, यह इस विधि के साथ अज्ञात मेटाबोलाइट्स की पहचान करना संभव नहीं है.
हाल के वर्षों में, उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRMS) उपकरणों ऐसे LTQ-Orbitrap और Exactive श्रृंखला, QuanTof के रूप में, जारी है, और TripleTOF 5600 16-18,22 किया गया है. HRMS कुछ पीपीएम के एक त्रुटि के भीतर बरकरार आयनों के अनुपात (मी / z) चार्ज करने के लिए एक बड़े पैमाने पर प्रदान कर सकते हैं. इसलिए, सभी अग्रदूत आयनों (यानी पूर्ण स्कैन मोड) का पता लगाने के द्वारा संचालित एक HRMS साधन सटीक जन और analyte के परिणामस्वरूप मौलिक रचना से सीधा संरचनात्मक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, और इस जानकारी को संभावित मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, एक यौगिक के बारे में सभी जानकारी संरचनात्मक isomers के स्तर तक, एक सटीक जन के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, एक पूर्णस्कैन विधि मेटाबोलाइट्स के पिछले ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और विधि अनुकूलन की आवश्यकता नहीं है. मी / z स्कैन सीमा में पड़ने वाले सभी आयनों का विश्लेषण किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, HRMS MRM विधि की तुलना में एक ही समय में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि मेटाबोलाइट्स की संख्या के मामले में एक लगभग असीमित क्षमता है. HRMS कारण स्कैन एक पूर्ण एमएस में प्राप्त किया जा सकता है कि डेटा बिंदुओं की एक तुलनीय संख्या में जिसके परिणामस्वरूप कम शुल्क साइकिल को भी मात्रात्मक क्षमता में एक ट्रिपल quadrupole एम आर एम के बराबर है. इसलिए, HRMS मात्रात्मक metabolomics के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है. हाल ही में, HRMS के एक उन्नत संस्करण (QE एमएस) पता लगाने रेंज 19 फैलता है जो एक ही तरीका है, में पर्याप्त तेजी से समय चक्र के साथ सकारात्मक और नकारात्मक मोड के बीच स्विच के तहत संचालित किया जा सकता क्यू Exactive मास स्पेक्ट्रोमेट्री करार दिया. यहाँ हम QE एमएस का उपयोग हमारी metabolomics रणनीति का वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं में सफल metabolite रूपरेखा के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) मध्यम विकास और कोशिकाओं से सावधान निकासी को नियंत्रित; 2) quantitation के लिए एक शिखर भर में पर्याप्त (आमतौर पर कम से कम 10) डेटा ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों जन अंशांकन और डाटा प्रोसेसिंग पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए Detlef शुमान, जेनिफर सटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और नथानिएल स्नाइडर (पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) स्वीकार करना चाहते हैं. इस प्रकाशन में सूचना दी अनुसंधान पुरस्कार संख्या R00CA168997 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
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