Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica
Summary
Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.
Abstract
Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l'incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.
Introduction
Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro 1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati 5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio 13 metaboliti C etichettati, sono NMR attivo 10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativamente elevata purezza del campione e grandi quantità di campione, il che limita le sue applicazioni in metabolomica. Nel frattempo, i dati raccolti da NMR analisi delle esigenze intensiva e assegnazione composta di spettri NMR complesso è difficile. GC-MS è stato ampiamente utilizzato per metaboliti polari e studi lipidici, ma richiede componen volatilids e quindi spesso derivatizzazione dei metaboliti, che a volte coinvolge la chimica complessa che può richiedere molto tempo e introduce rumore sperimentale.
Cromatografia liquida (LC) accoppiato a tripla spettrometria di massa a quadrupolo utilizza il primo quadrupolo per selezionare gli ioni madri intatte, che vengono poi frammentate nel secondo quadrupolo, mentre il terzo quadrupolo viene utilizzato per selezionare frammenti caratteristici o ioni figlia. Questo metodo, che registra il passaggio da ioni madri a specifici ioni figlia, è denominata multiple reaction monitoring (MRM). MRM è un metodo molto sensibile, preciso e robusto sia per piccole molecole e proteine quantificazione 12-15,21. Tuttavia, MRM ha i suoi limiti. Per ottenere un'elevata specificità di un metodo MRM deve essere costruita per ogni metabolita. Questo metodo consiste nell'identificare un frammento specifico e corrispondente energia di collisione ottimizzata, che richiede pre-conoscenza della propeproprietā dei metaboliti di interesse, come ad esempio informazioni di struttura chimica. Pertanto, con alcune eccezioni che comportano la perdita neutro di frammenti comuni, non è possibile identificare metaboliti non noti con questo metodo.
Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) strumenti sono stati rilasciati, come la serie LTQ-Orbitrap e Exactive, il QuanTof, e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS possono fornire una massa rapporto carica (m / z) degli ioni intatto, per un errore di pochi ppm. Pertanto, uno strumento HRMS operato da rilevare tutti gli ioni precursori (cioè modalità di scansione completa) può ottenere informazioni strutturali diretto dalla massa esatta e la composizione elementare risultante dell'analita, e queste informazioni possono essere utilizzate per identificare potenziali metaboliti. Infatti, tutte le informazioni relative ad un composto può essere ottenuta con una massa esatta, fino al livello di isomeri strutturali. Inoltre, una completametodo di scansione non richiede conoscenza precedente dei metaboliti e non richiede l'ottimizzazione metodo. Inoltre, poiché tutti gli ioni con m / z compreso nel range di scansione possono essere analizzati, HRMS ha una capacità praticamente illimitata in termini di numero di metaboliti che possono essere quantificati in una sola passata rispetto al metodo MRM. HRMS è paragonabile ad un MRM triplo quadrupolo capacità quantitativa causa del breve ciclo di lavoro con un conseguente numero paragonabile di punti di dati che possono essere ottenuti in una MS scansione completa. Pertanto, HRMS offre un approccio alternativo per metabolomica quantitativi. Recentemente, una versione migliorata del HRMS chiamato spettrometria di massa Q-Exactive (QE-MS) può essere utilizzato sotto la commutazione tra i modi positivi e negativi con tempi di ciclo sufficientemente veloce in un unico metodo, che amplia il campo di rilevamento 19. Qui si descrive la nostra strategia metabolomica utilizzando il QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l'iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Università della Pennsylvania) per le discussioni importanti sul calibrazione di massa ed elaborazione dei dati. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R00CA168997. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
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